氮源对紫球藻和蓝隐藻胞外多糖及藻胆蛋白含量的影响❋

梁 英， 胡乃霞， 黄徐林,2， 田传远， 闫译允， 王 帅

(1. 海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学)，山东 青岛 266003； 2. 广东海大集团股份有限公司，广东 广州 511400； 3. 海洋活性物质与现代分析技术重点实验室(自然资源部第一海洋研究所,山东 青岛 266061)

微藻种类繁多，数量庞大，在水域生态系统中扮演主要初级生产者的角色[1]。由于微藻具有进化多源性和遗传多样性，可以产生众多独具特色、结构新颖的次级代谢产物[2-4]。其中，胞外多糖是微藻在生长过程中向外分泌的胞外产物的主要组成成分[5]，具有许多特殊的理化性质和生物活性[6]。藻胆蛋白属于捕光色素蛋白，不仅在光合作用中起到吸收和传递能量的作用，而且还能在氮源缺乏的情况下作为储存蛋白供微藻继续生存[7]。目前，国内外研究发现微藻胞外多糖和藻胆蛋白具有许多重要的药用价值[8-12]，其含量变化很大程度上与微藻种类及培养条件有关[13-18]。

氮是四大基本元素之一，为细胞进行能量代谢和物质代谢等重要生命活动所必需[19]，大多数微藻主要利用硝态氮、铵态氮和有机氮等形式[20]。近年来，已有学者进行了氮源对微藻生长、胞外多糖及藻胆蛋白含量影响方面的研究[14-17]。尤珊等[14]研究发现以尿素和硝酸钠为氮源时均有利于钝顶螺旋藻(Spirulinapla-tensis)的生长，但藻细胞对硝酸钠的利用率更高，陈新美等[15]则发现用适宜质量浓度的尿素代替硝酸钠为氮源培养钝顶螺旋藻时，既可以加快细胞生长又利于增加其藻胆蛋白含量。李战[16]的实验结果表明，铵盐对淡色紫球藻(Porphyridiumpurpureum806)和血色紫球藻(Porphyridiumcruentum)分泌胞外多糖有促进作用，史磊[17]的实验结果则表明，铵盐对紫球藻分泌胞外多糖无促进作用。上述研究结果表明，氮源对微藻生长、胞外多糖及藻胆蛋白含量的影响与微藻种类及培养条件有关，即使对同一种微藻的研究，不同学者也得出了不同的结论，因此需要进一步研究。

紫球藻(Porphyridiumsp.)是一种单细胞红藻[21]，内有一大而呈星形的色素体，贮存着大量藻胆蛋白[22]，一般进入生长稳定期后，紫球藻会在细胞膜外层分泌胞外多糖形成粘质鞘[23]。蓝隐藻(Chroomonasplacoidea)是隐藻门(Cryptophyta)中的一种运动微藻[24]，藻细胞内只含有一种藻胆蛋白[25]。目前，仅见李战[16]和史磊[17]有关氮源对紫球藻胞外多糖含量影响的报道以及肖华山等[18]有关氮源对紫球藻藻胆蛋白含量影响的报道，还未见氮源对蓝隐藻生长、胞外多糖及藻胆蛋白含量影响的报道。本文以紫球藻和蓝隐藻为研究对象，比较分析了不同氮源对2种微藻的生长、叶绿素荧光参数、胞外多糖和藻胆蛋白含量的影响，以期为2种微藻的培养及开发利用提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 藻种来源

实验所用藻种均取自中国海洋大学微藻种质库，分别为紫球藻(Porphyridiumsp.，MACC/A165)和蓝隐藻(Chroomonasplacoidea，MACC/T11)。

1.2 实验设计

以f/2培养基[26]为基础，选取硝酸钠、氯化铵、脲和硝酸铵4种氮源，实验浓度分别为74.8，47.0，26.4和35.2 mg/L，每种氮源的氮浓度均与f/2培养基的氮浓度(12.3 mg/L)相同，每种氮源设置3个平行。定时(次/2 d)定量(5 mL/次)取样测定叶绿素荧光参数和细胞密度，培养结束后测定微藻干重、胞外多糖和藻胆蛋白含量。

1.3 培养条件

2种微藻均在500 mL三角烧瓶中进行培养，紫球藻初始接种密度为1.86×105个/mL，蓝隐藻初始接种密度为1.29×105个/mL。温度(23±1) ℃，盐度32，光照周期18L∶6D，光照强度60 μmol·m-2·s-1，连续充气培养，培养周期10 d。

1.4 测定方法

按Liang等[27]方法测定叶绿素荧光参数Fv/Fm(光系统II最大光能转化效率)、rETR(相对电子传递效率)、qP(光化学淬灭系数)和NPQ(非光化学淬灭系数)，紫球藻和蓝隐藻的细胞密度分别通过标准曲线法和血球计数板法进行测定，干重分别通过标准曲线法和冷冻干燥法进行测定，胞外多糖和藻胆蛋白含量分别用苯酚硫酸法[28]和蛋白试剂盒进行测定。

1.5 数据处理

用Origin8.5软件绘制图形，用SPSS19.0软件对数据进行单因子方差分析和多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1不同氮源对紫球藻叶绿素荧光参数的影响

图1A～D反映了不同氮源对紫球藻叶绿素荧光参数的影响。由图1可以看出，在整个培养周期内， 不同氮源处理组的Fv/Fm、rETR和qP值总体呈下降趋势。第2～4天，氯化铵处理组的Fv/Fm值最大，但第6～10天该值迅速下降，第8～10天硝酸钠处理组的Fv/Fm值显著高于其他处理组。第8～10天，硝酸钠处理组的rETR值最大，氯化铵处理组的rETR值最小。从第2天开始，4种氮源对紫球藻的qP值均有显著影响(P<0.05)，第8～10天，硝酸钠处理组的qP值显著高于其他各组，氯化铵处理组的qP值显著低于其他各组。实验结束时，氯化铵处理组的上述3个荧光参数均显著低于其他3组。氮源对紫球藻NPQ值的影响随着培养时间的不同而变化，第0～4天，各氮源处理组的NPQ值无显著差异(P>0.05)，第4～10天，氯化铵和脲处理组的NPQ值整体处于上升趋势，2个硝酸盐处理组的NPQ值在第6天达到最大值后持续下降，第8～10天，氯化铵和脲处理组的NPQ值显著高于2个硝酸盐处理组。

2.2不同氮源对紫球藻细胞密度、干重、胞外多糖和藻胆蛋白含量的影响

不同氮源对紫球藻细胞密度、干重、胞外多糖和藻胆蛋白含量的影响见图2A～D。从图2中可以得出，4个氮源处理组紫球藻的细胞密度在实验周期内一直呈上升趋势。多重比较结果显示，实验结束时硝酸钠处理组的细胞密度最高(6.13×106个/mL)，氯化铵处理组的最终细胞密度最低(4.95×106个/mL)，且2个处理组均与硝酸铵和脲处理组差异显著(P<0.05)。不同氮源对细胞干重和藻胆蛋白含量的影响规律相似：硝酸钠处理组的干重最高(1.4 g/L)，氯化铵处理组的干重最低(0.8 g/L)；2个硝酸盐处理组的藻胆蛋白含量差异不显著(P>0.05)，但均显著高于氯化铵处理组，其中，硝酸铵处理组的藻胆蛋白含量最大，占干重的17.5%。该藻胞外多糖含量随不同氮源的变化趋势与藻胆蛋白相反，以氯化铵为氮源时，紫球藻胞外多糖含量最高(占干重的29.0%)，显著高于2个硝酸盐处理组，但与脲处理组差异不显著(P>0.05)。

(abc表示方差分析差异程度，相同字母表明处理组间差异不显著(P>0.05)；不同字母表明处理组间差异显著(P<0.05)。 abc indicates variance analysis in the difference degree, the same letters indicates no significant difference from each other (P>0.05); The different letters indicates a significant difference from each other (P<0.05).)

2.3不同氮源对蓝隐藻叶绿素荧光参数的影响

蓝隐藻在不同氮源培养条件下叶绿素荧光参数的变化趋势见图3A～D。如图3所示，在整个培养周期中，各个氮源处理组的叶绿素荧光参数Fv/Fm、rETR和qP值变化规律相似，除氯化铵处理组的rETR值以外，其他处理组的上述参数均在第2天达到最大值后持续下降。多重比较结果显示，第6～10天，硝酸钠处理组的Fv/Fm值显著高于其他处理组，氯化铵处理组的Fv/Fm值则显著低于其他处理组。第4～10天，硝酸钠处理组的rETR值最大，氯化铵处理组的rETR值最小。从第4天开始，不同氮源对蓝隐藻的qP值均有显著影响(P<0.05)，并且氯化铵处理组的qP值均显著低于其他处理组，实验结束时硝酸钠处理组的qP值显著高于其他处理组。不同氮源对蓝隐藻NPQ值的影响与其他参数不同，第2～10天，氯化铵处理组的NPQ值最大，且第8～10天，氯化铵处理组的NPQ值显著大于其他3个处理组。

2.4不同氮源对蓝隐藻细胞密度、干重、胞外多糖和藻胆蛋白含量的影响

图4A～D表示蓝隐藻在不同氮源培养条件下其细胞密度、干重、胞外多糖和藻胆蛋白含量的变化趋势。由图4可知，4个处理组的细胞密度在整个实验周期内均呈上升趋势，多重比较结果显示，第6～10天氯化铵处理组的细胞密度显著低于其他处理组。实验结束时，硝酸钠处理组的细胞密度最高(9.2×105个/mL)，与硝酸铵处理组无显著差异(P>0.05)，氯化铵处理组的细胞密度最低(5.2×105个/mL)。单因子方差分析结果表明，不同氮源对蓝隐藻的干重、胞外多糖和藻胆蛋白含量的影响差异显著(P<0.05)。多重比较结果显示，硝酸钠处理组的干重最高(0.72 g/L)，显著高于其他3个处理组，氯化铵处理组的干重最低(0.52 g/L)，显著低于其他3个处理组。脲和氯化铵处理组的胞外多糖含量显著高于硝酸铵和硝酸钠处理组，其中脲处理组的胞外多糖含量最高，占干重的17.5%，但与氯化铵处理组差异不显著(P>0.05)。该藻藻胆蛋白含量随不同氮源的变化趋势与胞外多糖相反，硝酸铵和硝酸钠处理组的藻胆蛋白含量显著高于脲和氯化铵处理组，其中硝酸铵处理组的藻胆蛋白含量最高，占干重的18.8%，但与硝酸钠处理组差异不显著(P>0.05)，氯化铵处理组的藻胆蛋白含量最低，仅占干重的6.7%。

(abc表示方差分析差异程度，相同字母表明处理组间差异不显著(P>0.05)；不同字母表明处理组间差异显著(P<0.05)。abc indicates variance analysis in the difference degree, the same letters indicates no significant difference from each other (P>0.05); The different letters indicates a significant difference from each other (P<0.05).)

3 讨论

植物叶绿素荧光的强弱变化可以有效地反映光合作用信息[29-30]，基于此特点叶绿素荧光技术已经获得快速发展。Fv/Fm表示光系统II最大光能转化效率，反映了环境变化对微藻光合作用的影响，该值在环境胁迫条件下会明显下降[31-32]。本实验结果表明，紫球藻和蓝隐藻硝酸钠处理组的Fv/Fm值分别在第8～10天和第6～10天显著大于其他处理组，说明以硝酸钠为氮源时，藻细胞可以获得有效氮素，并且促使光系统II反应中心增大开放比例，进而提高了光能转换效率[33]。这与范丽敏[34]以硝酸钠为氮源培养棕鞭藻(Ochrosphaeroneopolitana)和球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)时，得出其Fv/Fm值均高于氯化铵和尿素处理组的结果一致。rETR表示相对电子传递效率[35]，实验结束时，2种微藻硝酸钠处理组的rETR值最大，而氯化铵处理组的rETR值最小，表明氯化铵作为氮源阻碍了藻细胞同化力形成，不利于光合电子传递，导致电子传递速率下降[35]。qP表示光化学淬灭，反映了光系统II中原初电子受体QA的还原状态[36]，该值下降意味着参与光合作用的电子数目减少，而以热的形式耗散的光能逐渐增加[37]。实验结束时，2种微藻硝酸钠处理组的qP值均显著高于其他处理组，这说明以硝酸钠为氮源时，紫球藻和蓝隐藻的QA数量最多，即电子传递速率最大，保证光合作用可以正常进行。而以氯化铵为氮源时，2种微藻的上述3个荧光参数最小，且显著低于硝酸钠处理组，可能是在该氮浓度下，铵态氮对藻细胞有一定的毒害作用[38]，使得PSII反应中心受损，抑制了电子传递过程。NPQ表示非光化学淬灭，将不能及时耗散的光能传递至周围环境中以避免对光合机构的破坏是微藻进化过程中自我保护的一种体现[36]。第2～10天，紫球藻和蓝隐藻氯化铵处理组的NPQ值均最大，可能以氯化铵为氮源时，铵态氮的毒害作用使藻细胞的光合结构受到破坏，不能充分利用光能，光能大量散失使得NPQ值升高，这一结果正与前者相吻合。

研究发现，氮源对微藻的胞外多糖和藻胆蛋白含量也有显著影响[16-18]，李战[16]的实验结果表明，铵盐对紫球藻分泌胞外多糖有促进作用，而史磊[17]的研究结果表明，硝酸钠对紫球藻分泌胞外多糖有促进作用，尿素和氯化铵则不起促进作用。我们的实验结果表明，紫球藻氯化铵处理组的胞外多糖含量显著高于2个硝酸盐处理组，蓝隐藻脲和氯化铵处理组的胞外多糖含量显著高于2个硝酸盐处理组，说明氯化铵促进紫球藻和蓝隐藻分泌胞外多糖，与李战[16]对紫球藻的研究结果一致。但与史磊[17]的研究结果不同，这种差异主要与实验藻种、培养基硝酸钠浓度和培养条件有关，史磊[17]实验所用紫球藻由其所在单位提供，培养基硝酸钠浓度为3.225 g/L，在恒温振荡光照培养箱中培养15 d；而本实验所用藻种来自中国海洋大学微藻种质库，培养基硝酸钠浓度为74.8 mg/L，连续充气培养10 d。但是，以氯化铵为氮源培养2种微藻以获取胞外多糖时，藻细胞生长较慢且生物量较低，以脲为氮源时，2种微藻的胞外多糖含量与氯化铵处理组无显著差异，而且藻细胞生长较好，加之脲的价格实惠，可以降低生产成本，综合考虑生物量、胞外多糖含量以及生产成本，本文认为通过培养紫球藻和蓝隐藻以获取胞外多糖时，脲是较为理想的氮源。肖华山等[18]研究发现当培养基中以硝酸钠和硝酸钾为氮源时，紫球藻可以合成大量藻胆蛋白，反之则分泌大量胞外多糖。本实验也得出了相同的结果，即紫球藻2个硝酸盐处理组的藻胆蛋白含量显著高于氯化铵处理组，蓝隐藻2个硝酸盐处理组的藻胆蛋白含量显著高于脲和氯化铵处理组，说明紫球藻和蓝隐藻以硝酸盐为氮源时可以促进藻胆蛋白合成，但会抑制胞外多糖分泌。王长海等[21]认为当紫球藻培养液中缺乏硝酸盐时，蛋白质合成受到抑制，大多数碳化物转化为多糖，因此蛋白质含量下降，多糖含量上升，与本实验结果一致。综合考虑2种微藻的光合活性、生长、生物量以及藻胆蛋白含量，认为硝酸钠是获取2种微藻藻胆蛋白的较理想氮源。综上所述，氮源对紫球藻和蓝隐藻的胞外多糖和藻胆蛋白含量有显著影响，可以根据所需的活性物质选择合适的氮源，以满足对这2种微藻开发利用的需要。

4 结语

不同氮源对紫球藻和蓝隐藻的叶绿素荧光参数、细胞密度、干重、胞外多糖和藻胆蛋白含量均有显著影响。以硝酸钠为氮源有利于2种微藻的生长和光合作用，以氯化铵为氮源则抑制2种微藻的生长和光合作用；有利于紫球藻分泌胞外多糖和合成藻胆蛋白的最佳氮源分别是氯化铵和硝酸铵；有利于蓝隐藻分泌胞外多糖和合成藻胆蛋白的最佳氮源分别是脲和硝酸铵。综合考虑光合活性、生长、生物量和活性物质含量，本文认为，获取2种微藻胞外多糖的较理想氮源是脲，获取2种微藻藻胆蛋白的较理想氮源是硝酸钠。