大黄素对重症急性胰腺炎大鼠淋巴细胞功能的影响

邹蕾 黄志远 杨桥 金红旭

作为一种常见的外科急腹症，重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)的主要病理特征为胰腺弥漫性出血和组织坏死，并伴有全身性免疫功能紊乱，其发病急骤、病情凶险、进展快、预后差、病死率高[1,2]。关于其发病机制目前尚不完全清楚，但有观点认为胰腺消化酶的激活导致胰腺自身发生消化，期间胰腺细胞和间质出现水肿，使全身炎性反应瀑布系统被激活，最终引发全身炎性反应综合征(systemic inflammatory respone syndrome,SIRS)以及多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)而导致机体死亡[3,4]。免疫过激引发的全身炎性反应综合征和多器官功能障碍综合征所致的早期死亡，以及免疫抑制引起感染加重所致的疾病后期死亡是该病死亡的两个高峰[5]。作为中草药大黄的有效成分，大黄素(Emodin，EMO，1,3,8-三羟基-6-甲基-9,10-蒽醌)是一种广泛存在于大黄、芦荟、虎杖等蓼科药用植物中的羟基蒽醌类化合物。近年来大黄素被证实对重症急性胰腺炎有较好的治疗效果[6]。然而，关于其对淋巴细胞影响的报道笔者所见仍不多见，因此，本研究以重症急性胰腺炎大鼠为实验模型，探讨大黄素对淋巴细胞功能的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂与仪器 45只SPF 级健康雄性SD大鼠，采购自北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号SCXK(京)2012-0001，体重200～240 g，于北京维通利华实验动物技术有限公司采购，于60%～65%湿度、20～24℃室温，日光灯每天照射12 h以维持昼夜循环，适应性饲养1周，期间让其自由饮水饮食。牛磺胆酸钠和大黄素均于美国Sigma公司采购；CD3FITC、CD8PE、CD45Percp、CD4APC、CD16+56PE、CD19APC抗体、PE荧光直标大鼠Foxp3 检测试剂盒、大鼠 Bregs 流式试剂盒均购自美国eBscience公司；大鼠淋巴细胞分离液购自天津灏洋；白介素10(IL-10)、转化生长因子β1(TGF-β1)检测试剂盒购自Abcam。OLYMPUS BX50型光学显微镜；Eppendorf Centrifuge 5430R/5417R型离心机；流式细胞仪；Biosystems 7500 Fast Real-Time PGR System型PCR仪。

1.2 重症急性胰腺炎大鼠模型的建立 术前不限制饮水，但禁食12 h，称重后腹腔注射10%水合氯醛溶液以麻醉大鼠，之后将大鼠固定于手术台，腹部剪毛并常规消毒，铺巾，于上腹剑突下作切口进入腹腔，使十二指肠和胰胆管暴露，将胰胆管远端胆管近肝门处用无损伤血管夹双重夹住，于十二指肠乳头附近将0.45 mm 头皮针经十二指肠外壁穿入肠腔，逆行插入胰胆管末端并用血管夹将枕头固定。用微量泵以 0.1 ml/min的速度将新鲜配置的5%牛黄胆酸钠溶液(1 ml/kg)推注至主胰管内，完成后观察5 min，待周围组织出现棕红色改变即可拔出头皮针，无损伤血管夹继续夹闭 5 min以使各胰腺小叶内充分进入牛磺胆酸钠溶液，取下血管夹，将十二指肠复位并确认腹腔无活动性出血，关腹缝合。假手术组除不泵入牛磺胆酸钠外其他操作均相同。

1.3 实验动物分组及给药 45只SD大鼠随机分为3组，假手术组、SAP模型组和EMO治疗组，每组15只。给药方式：EMO治疗组建模后1 h腹腔注射大黄素；假手术组和SAP模型组腹腔注射等体积的0.9%氯化钠溶液。

1.4 HE染色观察胰腺组织病理学变化 取大鼠胰腺组织置于液氮中冷冻后用冰冻切片机切片，固定，60℃苏木精染色，流水冲洗，加1%盐酸乙醇，促蓝液返蓝，0.5%曙红液染色，依次经梯度乙醇脱水及二甲苯透明，最后用中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.6 流式细胞仪分析全血中Bregs细胞含量 治疗后24 h采集各组大鼠新鲜全血并各取0.5 ml，分别加适量1×红细胞裂解液置于室温下静置20 min，离心弃上清，加5%BSA混匀后4℃作用1 h，加细胞染色液清洗，离心弃上清，加大鼠Bregs流式试剂盒抗体，避光孵育40 min，之后细胞染色液清洗，离心弃上清，置于流式细胞仪上进行检测。

1.7 ELISA检测IL-10、TGF-β1 采集小鼠全血，分离血清，采用ELISA试剂盒检测IL-10、转化生长因子β1 (TGF-β1)水平，具体操作参照试剂盒说明书进行。

1.8 RT-qPCR检测淋巴细胞中Foxp3、CTLA-4的mRNA 取适量分离的淋巴细胞，用Trizol提取细胞中总RNA并进行反转录获取cDNA，以该cDNA为模板进行荧光定量PCR反应，检测组织中Foxp3、CTLA-4的表达水平。同时以β-actin作为内参基因。每个样本均进行3次重复实验。

2 结果

2.1 3组大鼠胰腺组织病理学变化 假手术组大鼠胰腺组织未见出血，白细胞浸润、坏死及破裂，小叶仅出现轻度水肿。SAP模型组可见腺泡完整性被破坏，腺泡细胞出血、水肿、坏死以及炎性细胞浸润，腺泡液外溢，胰腺小叶间隙增宽。EMO治疗组大鼠胰腺组织病理变化较SAP模型组显著改善，向假手术组发展。见图1。

假手术组SAP模型组EMO治疗组

图1 3组大鼠胰腺组织病理学变化(HE染色×200)

2.2 3组T淋巴细胞亚群(CD4+和CD8+)百分比 与假手术组相比，SAP模型组大鼠全血中CD4+细胞亚群百分比、CD4+/CD8+比值均降低，CD8+细胞亚群百分比升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与SAP模型组相比，EMO治疗组CD4+细胞亚群百分比、CD4+/CD8+比值显著升高，CD8+细胞亚群百分比显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 3组T淋巴细胞亚群(CD4+和CD8+)百分比

注：与假手术组比较，*P<0.05；与SAP模型组比较，#P<0.05

2.3 3组调节性T细胞(Tregs)和调节性B细胞(Bregs)含量 SAP模型组大鼠Tregs细胞比例较假手术组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；EMO治疗组Tregs细胞比例较SAP模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。SAP模型组大鼠Bregs细胞比例较假手术组显著降低(P<0.05)；EMO治疗组Bregs细胞比例较SAP模型组升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组Tregs和Bregs含量

注：与假手术组比较，*P<0.05；与SAP模型组比较，#P<0.05

2.4 3组IL-10和TGF-β1水平 与假手术组相比，SAP模型组大鼠血清中IL-10和TGF-β1水平显著降低(P<0.05)；EMO治疗组IL-10和TGF-β1水平高于SAP模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.5 3组淋巴细胞中Foxp3 、CTLA-4的mRNA 表达 SAP模型组Foxp3 mRNA及CTLA-4 mRNA水平显著高于假手术组(P<0.05)；与SAP模型组相比，EMO治疗组Foxp3 mRNA及CTLA-4 mRNA水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表3 3组大鼠血清中IL-10和TGF-β1水平

注：与假手术组比较，*P<0.05；与SAP模型组比较，#P<0.05

表4 各组淋巴细胞中Foxp3、CTLA-4的mRNA 相对表达量

注：与假手术组比较，*P<0.05；与SAP模型组比较，#P<0.05

3 讨论

全身性免疫功能紊乱是重症急性胰腺炎的伴发症状，病程早期常因免疫过激引发全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合症，后期则因免疫抑制加重感染，最终都导致了死亡的发生。以往研究证实大黄素具有抑菌抗炎、清除氧自由基和抗氧化、保护肝肾、利胆利尿、免疫调节等药理作用[7]。在重症急性胰腺炎中，大黄素可降低血清及胰腺组织中的白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素6(interleukin-6，IL-6)及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha-α，TNF-α)等炎性因子水平，抑制胰酶释放，保护肠黏膜，减轻对肾和心肌的损伤[8]。

本研究经胆胰管逆行推注牛磺胆酸钠建立重症急性胰腺炎大鼠模型，同时给予腹腔注射大黄素，HE染色发现SAP模型组大鼠胰腺组织出现明显病理变化，EMO治疗组病理变化显著改善，表明SAP大鼠模型建立成功，且证实大黄素对大鼠重症急性胰腺炎有治疗作用，可减轻胰腺组织的病理损伤。在机体炎性反应中，淋巴细胞不仅能通过促进免疫反应来清除病原微生物，还发挥免疫调节的功能，对过强的免疫应答具有抑制作用。作为淋巴细胞的主要组分之一，T细胞介导体液免疫，在成熟的T细胞表面均有CD3分子表达，但CD4、CD8却不同时表达，因此成熟的T细胞可被分为CD4+T细胞和CD8+T细胞两个亚群，两者的含量及比值常用来反映机体的免疫功能[9,10]。本研究发现SAP模型组大鼠CD4+T细胞含量及CD4+/CD8+比值均下降，EMO治疗组则显著升高，提示SAP模型组大鼠免疫功能受到抑制，EMO可提高机体免疫功能，从而减轻病理症状。

调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)在微生物感染、过敏反应、移植耐受及肿瘤免疫中均发挥重要作用。免疫抑制性和免疫无能性是Treg细胞的两大特性，其免疫抑制性的主要表现为，经TCR介导的信号刺激激活的Treg对CD4+和CD8+T淋巴细胞的活化和增殖具有抑制作用，并且无MHC限制性，同种同型或同种异型T细胞的增殖均可被抑制[11]；其免疫无能性的主要表现为，IL-2特异性抗原和抗原提呈细胞(APC)的刺激使Treg处于低反应状态，但IL-2高浓度时Treg在TCR刺激下则发生活化并增殖[12]。有效控制病原体T细胞反应之间的平衡以及调节导致严重炎症和组织破坏的过度T细胞反应是Treg最主要的功能。Treg过多或过少均引起免疫平衡失调，病情加重，因此Treg对机体免疫平衡具有重要作用[13]。文献报道，Treg细胞功能增强或数量增加均可使炎性反应减轻，然而对病原体的控制能力也降低。Foxp3m RNA及其编码的蛋白质于Treg上特异性表达，且介导Treg的表型、发育、活性及功能，Foxp3稳定且持续性高表达是Treg发挥正常功能活性的必备条件，因此Foxp3被作为Treg的特征性标志[14]。Treg免疫抑制性主要是通过分泌抑制性细胞因子及细胞接触等方式非特异性抑制CD4+和CD8+T淋巴细胞的增殖活化。膜表面分子CTLA-4能为T淋巴细胞的活化提供第二信号，以阻断其协同刺激通路，因而发挥介导Treg细胞接触抑制的作用[15]。淋巴细胞凋亡是目前公认的导致脓毒症免疫功能紊乱的主要原因，尤其是CD4+T淋巴细胞过度凋亡引起的免疫抑制[16]。本研究发现SAP模型组大鼠Tregs细胞比例较假手术组升高，EMO治疗组Tregs细胞比例较SAP模型组降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。SAP模型大鼠的Treg比例增加提示其功能活性强且对机体具有免疫抑制性，可能是CD4+T淋巴细胞凋亡增加使其比例升高；EMO使 Treg比例降低，分析原因可能是EMO促进了Treg凋亡或抑制了其他T淋巴细胞凋亡。Foxp3和CTLA-4变化与Treg一致，进一步证实Treg在SAP大鼠中具有免疫抑制作用，而EMO则可减轻这种免疫抑制，对SAP起到治疗作用。

调节性B细胞(regulatory B cell，Bregs)通过分泌抑制性抗体或抑制性细胞因子调节其他免疫细胞的功能，抑制过度炎性反应，参与机体免疫应答的调节，在免疫功能紊乱、自身免疫病及移植排斥等状态下亦发挥重要作用[17]。研究证实Bregs是分泌IL-10和TGF-β1的主要细胞，且其调节作用与两种细胞因子密切相关[18]。小鼠体外实验发现Bregs降低肿瘤坏死因子等细胞因子的表达是通过分泌IL-10以使细胞表面MHCⅡ类分子的表达减少。Bregs在炎症环境及细胞因子下被激活后才会大量分化并发挥生物学效应，Bregs活化后可上调Tregs表面抗原以使Tregs发生改变，T细胞介导的炎症进而转化为自限性炎症，最终导致自身免疫被抑制[19]。Bregs通过增加Tregs上Foxp3和CTLA-4的表达且依靠细胞间直接接触进而诱导Tregs的产生[20]。本研究中，SAP模型大鼠Bregs细胞比例较假手术组显著降低(P<0.05)；EMO治疗组较SAP模型组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。IL-10和TGF-β1分泌水平与Bregs细胞比例变化一致。推测可能是重症急性胰腺炎引起机体免疫功能严重紊乱，Bregs的激活受到抑制，含量降低，分泌及释放的IL-10和TGF-β1少，以致于无法及时纠正过度炎症反应，导致大量炎性因子的释放进一步对多器官造成损伤；EMO可能是通过促进Bregs的激活，加大了IL-10和TGF-β1的分泌及释放，进而抑制炎性反应，利于机体恢复。

综上所述，大黄素对重症急性胰腺炎具有治疗作用，可能是通过提高CD4+T细胞含量及CD4+/CD8+比值使机体免疫功能增强，或者通过降低Treg比例减轻机体免疫抑制状态，以及增加Bregs比例促进IL-10和TGF-β1的分泌及释放进而抑制炎性反应。