响应面法优化纳豆混合发酵工艺的研究

耿晓然，徐 慧，卢 鑫，袁耀武，张 伟

（1.河北农业大学 食品科技学院，河北 保定071000；2.河北农业大学 理工学院，河北 沧州 061000）

纳豆是由纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）发酵黄豆而得的功能性食品，富含卵磷脂、维生素、多种活性酶和微量元素，其中的纳豆激酶被证实可以溶解血栓、促进血液循环，有预防和治疗心血管疾病的功能［1-3］。此外，纳豆还具有抗病、抗衰老、预防骨质疏松、调节肠道等功能［4-6］。虽然纳豆具有极高的营养价值，但由于特殊的氨腥味，导致其在我国接受程度不高，市场占有率极低。相关研究表明，纳豆的特殊氨腥味来源于发酵过程中产生的一些氨氮类化合物和含硫化合物［7-8］。近些年，研究学者将目光集中于多菌种混合发酵工艺［9-12］，相比于单一菌种的发酵，利用混合菌种进行纳豆发酵，可以降低纳豆的氨腥味，改善纳豆的品质。

本试验以降低纳豆的氨腥味和提高纳豆品质为目的。首先，以纳豆激酶活力和挥发性盐基氮含量为指标，通过利用纳豆芽孢杆菌与酿酒酵母混合发酵，降低纳豆的氨腥味，使其适合我国居民食用；其次，为了提高纳豆品质，以纳豆激酶活力为指标，在单因素试验的基础上通过Plackett-Burman法设计试验［13］和响应面法［14-15］优化纳豆固态发酵工艺，最后确定高纳豆激酶活力的纳豆固态发酵最佳条件，从而为研制出适合我国居民食用的高品质纳豆产品提供科学依据，促进纳豆食品在我国的推广和销售。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌种：纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）ND10-5，本实验室前期选育获得；酿酒酵母，安琪酵母，安琪酵母股份有限公司；大豆：东北大豆，市售。

1.2 培养基

纳豆芽孢杆菌固体培养基（0.3%牛肉膏，0.5%蛋白胨，0.5%氯化钠，pH 7.0，1.5%琼脂）；种子培养基（固体培养基不加琼脂）；

酿酒酵母固体培养基（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂）；种子培养基（固体培养基不加琼脂）。

1.3 试验方法

1.3.1 传统纳豆发酵流程［16］选择完整颗粒饱满的东北大豆，清洗干净并在室温下用蒸馏水浸泡12 h；将沥干水分的豆粒平铺到规格相同的发酵杯中，厚度3 cm，121 ℃灭菌20 min；无菌条件下自然冷却到室温。将活化15 h的纳豆芽孢杆菌悬浮液按照6%的接种量喷洒在表面上，搅拌均匀，密封透气膜；将接种的大豆在37 ℃下发酵24 h，发酵结束后置于4 ℃的冰箱中后熟1 d，完成纳豆的制作，传统工艺下的纳豆激酶活力为1 059.21 U/g，挥发性盐基氮含量为152.47 mg/100g。

1.3.2 混合菌种发酵比例的确定 本试验中菌液浓度为OD600=0.5，设计菌株的比例（纳豆芽孢杆菌与酿酒酵母的比例）为10∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1，以混合菌悬液为发酵菌种，按照1.3.1发酵，发酵完成后检测纳豆测定纳豆激酶活力和挥发性盐基氮含量，确定最佳的菌种比例，并以最佳菌种比例作为后续单因素试验的基础条件。

1.3.3 纳豆激酶活力测定 参照杨明等［17］的方法测定。

1.3.4 挥发性盐基氮含量的测定 参照国标《GB 5009.228—2016 食品中挥发性盐基氮的测定》测定［18］。

1.3.5 感官评价标准 从发酵后的拉丝情况、色泽、口感和气味3个指标对纳豆进行感官评价（表1）。随机选择20个人对纳豆进行感官评价，取平均值作为感官评价的最终得分。

结晶岩孔壁安全度高，但钻遇断裂带、裂隙带、破碎带或低强度带等时，如有漏失，则漏失压力低(密度上限一般低于1 g/cm3)，调节泥浆密度难以满足压力，一般需采用空气钻井或堵漏措施；同时其坍塌压力高(密度下限一般高于2.5 g/cm3)，调节泥浆密度难以满足应力平衡要求，一般会通过坍塌扩径释放局部压力至应力重新平衡，为了维护孔壁安全，宜采用固壁或造壁技术护壁。

1.3.6 单因素试验 以混合菌种最佳比例为基础，以纳豆激酶活力为检测指标，分别确定大豆的含水量（50%、60%、70%、80%、90%、100%，w/w）、大豆厚度（1、2、3、4、5 cm）、蒸煮时间（20、25、30、35、40 min）、接种量（2%、4%、6%、8%、10%、12%，w/w）、发酵温度（31、34、37、40、43 ℃）和发酵时间（16、17、18、19、20、21、22、23、24 h）的较优条件。

1.3.7 响应面法优化纳豆发酵工艺 在单因素试验的基础上，以纳豆激酶活力作为响应目标，采用三步法，利用响应面法优化，得到纳豆最优发酵工艺。

（1）筛选试验设计——Plackett Burman：Plackett-Burman设计是1种常用的两水平试验设计方法。选取1.3.6的6个因素作为考察对象，在2个水平（1）和（-1）确定每个变量，并且进行总共12个试验以确定每个因子的影响水平。

（2）优化试验设计——最陡爬坡试验：根据1.3.6（1）的试验结果筛选得到对纳豆激酶活力影响显著的3个因素做最陡爬坡试验。

（3）优化试验设计——中心组合设计试验（CCD）：根据1.3.6（1）、1.3.6（2）试验结果，选择对发酵阶段影响显著的3个因素并设定中心点，以确定的3个因素（命名为A、B、C）为自变量，以纳豆激酶活力作为试验响应值，利用Design-Expert软件中的CCD试验对上述3个因素进行通用旋转中心组合设计。

2 结果与分析

2.1 混合菌种发酵比例的确定（图1）

以不加入酿酒酵母的处理为对照组，各混合比例菌种按照6%的接种量接种，发酵结束后测定挥发性盐基氮含量和纳豆激酶活力。纳豆激酶活力越高、挥发性盐基氮含量越低，则纳豆品质越好。由图1、图2可知，菌种比例为3∶1时，纳豆挥发性盐基氮含量最低为91.26 mg/100 g，纳豆激酶活力为1 229.85 U/g，综合以上结果，选择混合菌种比例为3∶ 1。

2.2 单因素法初步确定最佳发酵工艺条件

考查了大豆含水量、大豆厚度、蒸煮时间、接种量、发酵温度和发酵时间中任意单因素条件下纳豆中纳豆激酶活力的强弱，测定结果如图3—8所示。随着各个工艺参数的增加，纳豆激酶活力均呈现先增加后降低或平稳的趋势。当大豆含水量为70%、大豆层铺厚度为3 cm、大豆的蒸煮时间为30 min、接种量为6%、发酵温度为37 ℃时、发酵时间为24 h时，纳豆激酶活力达到最高，为1 370.22 U/g。

图3 大豆含水量对纳豆激酶活力的影响Fig.3 Effect of moisture on nattokinase activity

图4 大豆厚度对纳豆激酶活力的影响Fig.4 Effect of the thickness on nattokinase activity

图5 蒸煮时间对纳豆激酶活力的影响Fig.5 Effect of sterilizing time on nattokinase activity

图6 接种量对纳豆激酶活力的影响Fig.6 Effect of inoculation quantity on nattokinase activity

图7 发酵温度对纳豆激酶活力的影响Fig.7 Effect of temperature on nattokinase activity

图8 发酵时间对纳豆激酶活力的影响Fig.8 Effect of fermentation time on nattokinase activity

2.3 响应面分析法确定最佳发酵条件

2.3.1 Plackett Burman试验设计及结果 在单因素试验的基础上，按照Plackett Burman试验设计规则确定试验的因素水平，如表2所示。以纳豆激酶活力（Y）作为试验响应值，通过Design Expert8.0.6软件设计Plackett Burman试验，如表3所示，并对试验数据进行回归拟合，得回归方程：Y=2 474.67-12.80X1-78.11X2+8.91X3-37.64X4-17.64X5+24.67X6，R2=0.910 2。

表2 Plackett Burman试验设计的因素水平Table 2 Factor levels of Plackett Burman experiment

表3 Plackett Burman试验设计及结果Table 3 Design and result of Plackett Burman experiment

2.3.2 Plackett Burman试验的回归模型方差分析 由表4可知，P=0.016 7＜0.05，表明模型差异显著。本试验中R2=0.910 2＞0.9，表明预测值与试验值具有较高相关度。

表4 方差分析Table 4 ANOVA for the regression model in Plackett Burman experiment

2.3.3 Plackett Burman试验的回归方程系数显著性检验 由表5可知，X1大豆含水量（P＜0.01）呈极显著差异；X5发酵温度（0.01＜P＜0.05）呈显著差异；X6发酵时间（0.01＜P＜0.05）呈显著差异；其他影响因素呈不显著差异。6个影响因素对纳豆激酶活力的影响强弱顺序为：大豆含水量＞发酵温度＞发酵时间＞蒸煮时间＞大豆厚度＞接种量。

表5 回归方程系数显著性检验Table 5 Significance test for the regression equation coefficient in Plackett Burman experiment

2.3.4 最陡爬坡试验结果分析 由上述分析结果可知，大豆含水量和发酵温度与纳豆激酶活力呈显著负相关，发酵时间呈显著正相关。以大豆含水量、发酵温度和发酵时间这3个因素设计最陡爬坡试验，具体设计方法及结果见表6。由表6可知，3号试验的纳豆激酶活力最高，以3号试验为基础继续进行优化分析。

表6 最陡爬坡试验设计及结果Table 6 Steepest ascent design and corresponding results

2.3.5 CCD试验设计及结果利用 由表7—8综合分析，得到如下多元二次回归方程式：Y=-35 847.45+61.50*A+1 717.62*B+350.71*C+1.190*AB+0.25*AC-5.97BC-1.07*A2-23.45*B2-3.01*C2

表7 CCD试验设计的因素水平Table 7 Factor levels of CCD experiment

表8 CCD试验设计及结果Table 8 CCD experiment design and results

续表：

2.3.6 CCD试验回归模型方差分析 由表9可知，模型F=11.26，P＜0.01，表明模型极显著，对响应值Y的影响非常显著，可信度高，可用来进行响应值预测。纳豆激酶活力失拟项P=0.095 6＞0.05，呈不显著差异，表明未知因素对试验结果影响较小，所拟合的多元二次回归方程是可信的。一次项（A、B）对纳豆激酶活力有显著影响，但交互项（AB、AC、BC）均不显著，说明各个纳豆激酶发酵条件间的交互作用很小。

表9 二次回归模型方差分析表Table 9 Variance analysis of the regression quadratic model

2.3.7 响应面与等高线分析 图9至11直观地反映了各种因素之间相互作用对纳豆激酶活力的影响。从等高线图可以看出，等高线最小圆的中心在所选的范围内，响应曲面均为开口向下的凸形三维曲面，说明纳豆激酶活力值（Y）在变量（X）选择的值范围内具有最大值。

图9 大豆含水量和发酵时间对纳豆激酶活力交互用影响的响应面图和等高线图Fig.9 Response surface plot and contour plot for the interactive effects of moisture and fermentation time on nattokinase activity

图10 大豆含水量和发酵温度对纳豆激酶活力交互用影响的响应面图和等高线图Fig.10 Response surface plot and contour plot for the interactive effects of moisture and fermentation temperature on nattokinase activity

图11 发酵时间和发酵温度对纳豆激酶活力交互用影响的响应面图和等高线图Fig.11 Response surface plot and contour plot for the interactive effects of fermentation time and fermentation temperature on nattokinase activity

2.3.8 纳豆固态发酵最优工艺条件的确定 根据单因素试验、Plackett Burman试验、CCD试验和响应面分析得到了纳豆发酵的最优条件：大豆的含水量为60%、发酵温度为35 ℃、发酵时间为28 h、大豆平铺厚度3 cm、接种量6%、蒸煮时间30 min。此条件下的纳豆激酶活力为1 473.37 U/g，与理论值无显著差异。因此，基于Plackett Burman试验的中心组合试验获得的最优工艺条件是可靠的。

3 结论与讨论

本文首先利用纳豆芽孢杆菌与酿酒酵母混合进行纳豆固态发酵，确定了混合菌株比例为3∶1，此条件下的挥发性盐基氮含量为91.26 mg/100 g，比优化前降低了40.1%，降低了纳豆的氨腥味；在此基础上为了提高纳豆品质，通过单因素试验和响应面法优化了纳豆固态发酵工艺，最终确定了纳豆固态发酵最优工艺条件为：大豆含水量为60%、发酵温度为35 ℃、发酵时间为28 h、大豆平铺厚度3 cm、接种量6%、蒸煮时间30 min。在此发酵条件下纳豆激酶活力为1 473.37 U/g，比优化前提高了39.1%，纳豆感官评价值为98分，并有淡淡的醇香，纳豆品质较好。

纳豆因其特有的氨腥味，部分国内消费者难以接受。目前，关于纳豆的研究多集中于菌种选育［20,21］及发酵条件优化［22-23］上，本试验采用纳豆芽孢杆菌与酿酒酵母混合进行纳豆固态发酵，并利用单因素试验和响应面法对发酵工艺进行优化，不但提高了纳豆激酶活力，并且降低了纳豆的氨腥味，改善了纳豆的口感和品质，为纳豆产品在我国的推广提供了一定的技术指导和借鉴。