雷美替胺对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育的影响

2020-04-22孙婧陶郝耘初张文涵朱彦龙王张钰金君学

中国畜牧杂志 2020年4期

孙婧陶，郝耘初，张文涵，朱彦龙，王张钰，金君学

（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030）

我国是猪肉产业大国，猪是重要的农业经济动物，并且猪在解剖学、生理学、遗传背景及疾病特征等方面与人类相似，被认为是人体异种器官来源的首选动物，因此猪在生物医学研究中是重要的模式动物[1]。体外生产技术和基因编辑技术的有效结合不仅促进了胚胎工程的发展及应用，而且带动了医学领域的发展。胚胎体外生产（In Vitro Production，IVP）需要大量高质量的卵母细胞。相较体内环境而言，体外发育的卵母细胞及早期胚胎发育能力更易受到影响，这很可能是活性氧（ROS）引起的氧化应激造成了胚胎细胞凋亡或永久性发育阻滞[2-3]。为提高卵母细胞体外成熟率和胚胎体外发育率，研究者在卵母细胞体外成熟体系中添加维生素[4]、亚硒酸钠[5]、白藜芦醇[6]、褪黑素[7]等抗氧化剂。其中，褪黑素作为抗氧化剂在人体中广泛分布，但半衰期过短[8]。褪黑素受体（MT）是一类G 蛋白偶连受体[9]，在哺乳动物中表达的亚型为MT1 和MT2[10]。雷美替胺是一种MT1 和MT2 受体激动剂，比褪黑素有更长的半衰期，且亲和性高于褪黑素[11]。目前，尚无在猪卵母细胞体外成熟过程中添加褪黑素受体激动剂雷美替胺的研究。因此，本研究旨在探究不同浓度雷美替胺对猪卵丘细胞扩增、卵母细胞体外成熟（In Vitro Maturation，IVM）及胞质内谷胱甘肽（GSH）和ROS 水平、孤雌胚胎发育能力及胚胎发育相关基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料本研究所有实验试剂均购置于Sigma（美国）公司，特殊说明的除外。

1.2 实验方法

1.2.1 猪卵母细胞体外成熟培养从屠宰场获得猪卵巢，放于28～35℃生理盐水中，2 h 内运回实验室。用18 号针头抽取直径为3～6 mm 的卵丘卵母细胞复合体（Cumulus-oocyte Complexs，COCs）。随后将COCs转移至IVM 培养液中培养21 h，然后再转移至无激素的IVM 培养液中继续培养21 h。矿物油覆盖在4 孔板的IVM 培养液中，并在38.5℃、5%CO2饱和湿度环境下培养。

IVM 培养液采用TCM-199（Invitrogen）作为基础培养液，添加0.6 mmol/L 半胱氨酸、0.91 mmol/L丙酮酸钠、5 μL/mL 的 ITS-A（100X）（Invitrogen）、10 ng/mL EGF、10%猪卵泡液、10 IU/mL PMSG、10 IU/mL hCG、1% 青链霉素（Invitrogen）。在 IVM 培养液中，分别添加10-11、10-9、10-7、10-5mol/L 的雷美替胺（APExBIO）作为处理组，不添加雷美替胺组作为对照组，进行后续实验。

1.2.2 猪卵丘细胞扩散程度判定和分级卵母细胞体外培养结束后，对卵丘细胞的扩散情况进行评估[12-13]：0 级，卵丘细胞无任何扩散；1 级，只有卵丘细胞最外层稍有扩散；2 级，外层的卵丘细胞扩散；3 级，除放射冠外，其余卵丘细胞均扩散；4 级，包括放射冠在内的所有卵丘细胞均实现了最大程度的扩散。统计卵丘细胞扩散指数（Cumulus Expansion Index，CEI），即计算各级卵丘细胞扩散的加权算术平均数，用于衡量卵丘细胞扩散的指标。

1.2.3 猪卵母细胞ROS、GSH 染色观察成熟猪卵母细胞内ROS 水平和GSH 水平，分别使用H2DCFDA（2’，7’-dichlorodihdrofluorescein diacetate，Invitrogen) 和CellTracker Blue CMF2HC（4-chloromethy -6.8-difluoro-7-hydroxycoumarin，Invitrogen）染色，前者为绿色荧光，后者为蓝色荧光。在PBS 中分别添加10 μmol/L的H2DCFDA 和CellTracker Blue CMF2HC，将卵母细胞放于其中避光培养30 min。用PBS 洗涤3 次，置于4 μL 的TALP-HEPES 小滴中，在荧光显微镜下观察荧光（TE2000-S，Nikon），使用Image J 软件对ROS 和GSH 荧光强度进行分析，P＜0.05 表示差异显著。

1.2.4 猪卵母细胞孤雌激活（Parthenogenetic Activation，PA）将经0.1%透明质酸酶洗脱后的成熟卵置于激活液（0.28 mol/L 甘露醇、0.1 mmol/L CaCl2、0.1 mmol/L MgSO4、0.5 mmol/L HEPES）中，使用BTX ECM 2001激活，激活条件为1.5 kV/cm 的直流脉冲60 μs。激活后的卵母细胞放于PZM-5（Funakoshi Corporation）培养液中培养48 h 评估胚胎卵裂率，168 h 后评估囊胚率；并用Hoechst 33342 对囊胚进行染色，统计囊胚总细胞数。

1.2.5 实时荧光定量PCR 对10-11mol/L 雷美替胺处理组和对照组的孤雌囊胚进行胚胎发育相关基因mRNA 表达情况分析。总RNA 提取使用TRIzol Reagent（Invitrogen），具体方法参照说明书。总RNA 浓度及纯度使用Nano Drop 2000 分光光度计（Thermo Fisher Scientific）进行定量。使用Clontech 试剂盒（TaKaRa）将提取的总RNA 反转录为cDNA。反应体系20 μL：1 μL cDNA，上、下游引物各0.4 μL (10 pmol/μL)，10 μL SYBR Green Premix Ex Taq，8.2 μL NFW。反应条件：95 ℃变性 30 s、退火20 s、72℃延伸30 s，共40 个循环。本实验所用引物见表1，GAPDH 为看家基因。实施荧光定量PCR 结果采用 2-△△Ct法。

1.3 统计分析每组实验至少重复3 次。数据使用SPSS 17.0 通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey 检验（Tukey’s test）进行分析，数据使用平均值±标准误差（SEM）表示。基因表达差异使用t检验方法进行分析。P＜0.05 表示差异显著。

2 结果

2.1 不同浓度的雷美替胺对猪卵丘细胞扩散的影响由表2 可知，10-11、10-9mol/L 雷美替胺处理组卵丘细胞的扩散指数显著高于对照组。

2.2 不同浓度的雷美替胺对猪卵母细胞体外成熟的影响如表3 所示，不同处理组的卵母细胞成熟率为76.3%～87.7%，所有组别之间没有显著性差异。

2.3 不同浓度的雷美替胺对猪卵母细胞内GSH 和ROS的影响如图1 所示，雷美替胺处理组GSH 荧光强度均显著高于对照组，ROS 荧光强度均显著低于对照组。

表1 实时荧光定量PCR 引物序列

表2 不同浓度的雷美替胺对猪卵丘细胞扩散的影响

表3 不同浓度的雷美替胺对猪卵母细胞成熟率的影响

图1 不同浓度的雷美替胺对猪卵母细胞内GSH 和ROS荧光强度分析

2.4 不同浓度的雷美替胺对猪孤雌胚胎发育能力的影响由表4 可知，各组在卵裂率上无显著性差异；10-11mol/L处理组的囊胚率显著高于对照组；10-11mol/L 和10-9mol/L处理组囊胚总细胞数显著高于对照组。

2.5 雷美替胺对胚胎发育相关基因表达的影响荧光定量PCR 结果显示（图2），10-11mol/L 组的孤雌囊胚中POU5F1、NANOG和SOX2的 mRNA 表达量均显著高于对照组，与DNA 甲基化相关的DNMT3a和DNMT3b基因mRNA 表达量无显著性差异。

3 讨论

在畜牧生产领域中，卵母细胞体外成熟已成为现代胚胎生物技术的重要内容之一，是体外受精、核移植等生物技术的重要环节。COCs 是由卵母细胞和其周围的卵丘细胞组成，卵丘细胞在其生长和成熟过程中与卵母细胞在生理和代谢上结合，并参与排卵和受精。在卵泡生长过程中，卵丘细胞通过缝隙连接与卵母细胞紧密相连，缝隙连接允许双向旁分泌，从而调节染色质重塑和卵母细胞中RNA 合成等过程[14]。此外，卵丘细胞还参与抗氧化和代谢过程并提供脂肪酸、碳水化合物和氨基酸等能量底物给卵母细胞，进而提高卵母细胞发育[15]。因此，卵丘细胞对于卵母细胞的发育十分重要。本实验结果表明，10-11mol/L 和10-9mol/L 雷美替胺处理组的卵丘细胞扩散指数显著高于对照组。由此推断，10-11mol/L和10-9mol/L 雷美替胺处理组的卵母细胞发育能力高。随后本实验对卵母细胞成熟率进行统计，发现各处理组无显著性差异。由以上结果可知，卵丘细胞扩散程度的好坏与卵母细胞核成熟无明显关联，有可能与卵母细胞胞质成熟有关。目前众多学者认为，卵母细胞体外成熟后的GSH水平是标志卵母细胞胞质成熟的重要指标[16-17]。本研究结果显示，添加雷美替胺使卵母细胞内GSH 水平显著升高，ROS 水平显著降低，也证实雷美替胺促进了猪卵母细胞的胞质成熟，与雷美替胺能显著降低卵母细胞内氧化应激有关。

雷美替胺是一种褪黑素受体激动剂，对MT1 和MT2 受体有较强亲和力和内在活性，能通过受体兴奋发挥最大的效应。前期研究表明，褪黑素在小鼠[18]、绵羊[19]、牛[20]等哺乳动物的卵母细胞成熟及胚胎发育方面均有促进作用。在猪卵母细胞体外成熟过程中添加褪黑素，虽然未提高卵母细胞成熟率，但GSH 水平得到提升，同时增加了猪囊胚率及囊胚细胞数[21]。本实验中，雷美替胺能够通过促进胞质成熟，提高囊胚发育能力及囊胚质量。另外，前期研究也发现，在猪卵母细胞体外成熟过程中添加10-9mol/L 褪黑素，可提高囊胚发育能力[22]，而在本研究中低浓度的褪黑素受体激动剂雷美替胺（10-11mol/L）与高浓度的褪黑素（10-9mol/L）处理结果极为相似，这很可能与雷美替胺的亲和性比褪黑素更高有关。

表4 不同浓度的雷美替胺对猪孤雌胚胎发育能力的影响

图2 雷美替胺对胚胎发育相关基因的表达影响

转录因子POU5F1和NANOG基因在内细胞团中表达，并维持多能性。但是在猪囊胚中，POU5F1基因在内细胞团和滋养外胚层中均表达[23]。SOX2基因与POU5F1基因协同调节，来维持胚胎多能干细胞的表型[24]。胚胎中多能性因子的表达情况是衡量胚胎体外发育质量的重要指标。本研究结果证实，10-11mol/L 组的孤雌囊胚中POU5F1、NANOG和SOX2的 mRNA 表达量均显著高于对照组。