TLR-8 激动剂刺激的DC 对CD4+CD25+调节性T 细胞的体外增殖及杀伤功能的研究

杨阿丽，刘欣，王兴兵，汪安友，汪健

（安徽医科大学附属省立医院 血液内科，安徽 合肥）

0 引言

急性髓细胞白血病（AML）是一种常见的恶性血液病，目前主要治疗方法是化疗和造血干细胞移植。CD34+白血病细胞具有无限增殖、自我更新及多向分化的潜能，在体内选择性过度生长，并且干扰正常造血干细胞的分化，能逃逸大多数化疗药物的杀伤，处于相对静息状态的CD34+白血病细胞在体内可以长期潜伏，化疗不能完全消灭它[1]。目前有研究者认为CD34+白血病细胞是白血病起源、治疗后复发及耐药的主要根源[2]。Toll样受体（TLRs）作为模式识别受体中的一员，可以识别病原微生物的保守结构分子模式，通过胞内信号传导通路产生细胞因子和趋化因子，促进抗原提呈细胞（APCs）的成熟以及诱导适应性免疫应答[3],CD4+CD25+调节性T细胞（Tregs）参与机体免疫抑制功能，CD34+白血病细胞通过招募 Tregs并利用其功能来逃避机体的免疫监视，在白血病发生过程中参与激活白血病特异性[4]，故推测通过干预Tregs细胞的增殖和免疫抑制功能将可作为CD34+白血病细胞清除的一个靶点。

本研究通过TLR-8激动剂在体外条件下干预前后，观察负载CD34+白血病细胞的DC对CD4+CD25+调节性T细胞的体外增殖及杀伤功能的影响。

1 材料与方法

1.1 标本来源 初发的急性白血病患者经过骨髓细胞学、流式细胞术免疫分型、染色体核型分析、融合基因（MICM）检查确诊，采用WHO诊断分型。入组8例AML（M3除外）患者，男性5例，女性3例，年龄23-55岁，中位年龄42岁，M1 1例，M2 1例，M4 2例，M5 4例。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂

人淋巴细胞分离液：Solarbio公司；RPMI1640 培养基 ：美国Hyclone 生物科技有限公司。胎牛血清：杭州四季青公司；DMSO：美国Amresco公司；RPMI-1640培养基、0.25%胰蛋白酶溶液：美国Hyclone生物科技有限公司；磁珠（CD34抗体和FcR阻断剂，CD14抗体，CD8抗体、CD4抗体、抗生物素微球和CD25微球）：德国美天旎生物技术有限公司；去甲氧柔红霉素：辉瑞制药有限公司；硼替佐米：西安杨森制药有限公司；IL-4、GM-CSF、TNF-α：美国PeproTech公司；VTX-2337：美国ImmunoWay公司；双抗：青霉素、链霉素：赛业生物科技有限公司；冰醋酸、95%乙醇、75%乙醇、生理盐水、PBS晶体：上海生工生物公司；CD14-PE、CD25-FITC、7AAD、CD4-PE、CD3-APC、CD8-FITC、CFSE：美国 BD公司；DC培养液：50mL RPMI1640 培养基加入5mL胎牛血清，加入青霉素、链霉素（双抗浓度均为100U/mL），密封并置于4℃冰箱中保存；细胞冻存液：将DMSO与RPMI1640 培养基、血清按照1：7：3比例混合配置，配置为总体积为50mL的冻存液，封闭并并置于4℃冰箱中保存；PBS-E溶液：将PBS晶体溶于800mL蒸馏水中，调整pH为7.4左右，加蒸馏水定容至1000mL配成PBS溶液，每100mL溶液中加入1mLEDTA溶液，在高压蒸汽灭菌器中灭菌至少30分钟，室温保存；PBS-EB溶液：取45mLPBS-E溶液加入200ul胎牛血清，冰水浴放置，磁珠分选时临时配置用。

1.2.2 主要仪器

LS分选柱、MS分选柱、Mini MACS磁珠分选架：德国美天旎生物技术有限公司；流式细胞仪（FACSCanton Ⅱ型）：美国BD有限公司；倒置相差显微镜、显微照相系统：日本Olympus公司；图像分析系统：VideoTest Fish 2.0；低温超速离心机、超净工作台：江苏苏净集团安泰公司；CO2孵育箱:RSBiotech 公司。

2 方法

2.1 分选CD34+白血病细胞

2.1.1 细胞来源：签署知情同意书后，采集2017-2019年安徽医科大学附属省立医院安徽省立医院血液科初治AML（M3除外）患者的肝素抗凝的骨髓5mL。

2.1.2 提取单个核细胞并计数：将收集的骨髓用人淋巴细胞分离液采用密度梯度离心法提取单个核细胞并洗涤2次。弃上清，用手弹散底层细胞，加入RPMI1640至总体积5mL，混匀管内细胞液。取10μL至EP管中，加190μL冰醋酸稀释至20倍，充分分散细胞，吸取少许细胞悬液在光学显微镜下计数，重复计数3次，取平均值。细胞数/mL=（四大格细胞总数/4）×104×稀释倍数×细胞悬液总体（mL）。

2.1.3 磁珠分选CD34+白血病细胞：将2.1.2得到的单个核细胞离心、重悬后，在避光条件下加抗体阻断剂FcR及CD34+抗体磁珠，进行磁珠阴性分选，获得即为CD34+白血病细胞。

2.1.4 CD34+白血病细胞的冻存与复苏：将分选的CD34+白血病细胞冻存并保存于液氮罐中，待该患者达到完全缓解期时复苏备用。

2.2 树突状细胞的培养

2.2.1 细胞来源：签署同意书后，多次累计采集完全缓解期患者的外周血20mL，提取单个核细胞（PBMC）并计数，用CD14+抗体磁珠阴性分选获得CD14+单个核细胞，用作DC（步骤同2.1.2-2.1.3）。

2.2.2 培养成熟DC：用含10% FBS、1U/mL青霉素、1μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液将分选的单核细胞的浓度调整为2×106/2mL，置于6孔培养板中， 加入GM-CSF 1000 U/mL、IL-4 500 U/ mL（每孔液体量调为2mL），均匀吹打细胞，置于5%CO2，37℃培养箱中培养，每48小时观察细胞形态，半量换液及添加细胞因子，第5天再次半量换液，加入TNF-α 50 U/mL，继续5%CO2，37℃培养箱中培养48小时，收集细胞，获得成熟DC。

2.2.3 成熟DC的冻存与复苏：将2.2.2获取的细胞液移至离心管中，向每孔加入37℃预热的0.25%胰酶，将培养板置于培养箱中消化5分钟，待细胞充分消化后，向每孔加入2mL RPMI 1640培养液以停止细胞消化，收集成熟DC于无菌离心管中，冻存与复苏同2.1.4。

2.3 制备负载CD34+白血病细胞的DC

复苏冻存的CD34+的白血病细胞于6孔板中，加入RPMI 1640培养液，置于5%CO2，37℃培养箱中培养24小时，加入去甲氧柔红霉素（15ng/mL）联合硼替佐米（0.25μM），培养箱中继续培养18小时，收集细胞。冰上孵育30分钟后，洗涤2次，与DC按1：2混合培养2小时，收集细胞。

2.4 CTL 的生成

多次累计取完全缓解期患者外周血10mL，分离外周血单个核细胞（PBMC），将负载CD34+白血病细胞的DC与分离的PBMC按1：2共培养，第7天和第14天加入DC反复刺激。同时，从第3天起，每隔2-3天加入IL-2（20IU/mL）。第21天，采用磁珠阳性分选获得CD8+CTL。

2.5 CD4+CD25+T 细胞分选

多次累计取完全缓解期患者外周血10mL，分离外周血单个核细胞（PBMC），磁珠分选出CD4+T细胞，再通过抗CD25的磁珠分选获得将CD4+CD25+T细胞。

2.6 诱导调节性T 细胞增殖作用的检测

在6孔板中加入负载药物诱导凋亡CD34+白血病细胞的DC和 CFSE（2.5μmol/L）标记 CD4+CD25+T细胞（2×105个 / 2mL）按照10：1共培养，分为两组：1）对照组：仅加入含有10% FBS的RPMI 1640培养液；2）TLR-8激动剂组：加入含有10% FBS的RPMI 1640培养液及 TLR-8激动剂（VTX-2337，3μg/mL），分别于5%CO2，37℃培养箱中培养，7天后，利用流式细胞术检测CD4+CD25+T调节性T细胞的增殖情况。

2.7 TLR-8 激动剂干预下CD4+CD25+调节性T 细胞对CTL 杀伤CD34+白血病细胞作用的影响检测

2.7.1 TLR-8激动剂（VTX-2337）预处理CD4+CD25+调节性T细胞：分选的CD4+CD25+调节性T细胞（2×105个/2mL）在含有TLR-8激动剂(VTX-2337，3μg/mL)的介质中培养3天，洗涤后，用于下述试验。

2.7.2 杀伤实验：自体CD34+白血病细胞作为靶细胞，在5%CO2，37℃ 条件下用终浓度为2.5μmol/L的CFSE标记10min。洗3次去除残余的染料，并悬浮于完全培养基中。实验用U型96孔板，分为3组：1）空白组（单独靶细胞组）：靶细胞（自体CD34+白血病细胞）100μL，2）对照组：加入TLR-8激动剂（VTX-2337）预处理前CD4+CD25+调节性T细胞、效应细胞（CD8+CTL）和靶细胞（自体CD34+白血病细胞）各100μL，每孔均加900个靶细胞，效靶比分别为12.5:1、25:1，设置3个平行复孔；3）TLR-8激动剂组：加入TLR-8激动剂（VTX-2337）预处理后CD4+CD25+调节性T细胞、效应细胞（CD8+CTL）和靶细胞（自体CD34+白血病细胞）各100μl， 每孔均加900个靶细胞，效靶比分别为25:1、 12.5:1，设置3个平行复孔。120g离心2分钟，于5%CO2，37℃孵育4小时。共孵育结束后，加入5μL 7AAD（100μg/mL）置于冰浴5min，采用流式细胞术分析，测定CD8+CTL的杀伤功能。公式如下：杀伤活性（%）=7AAD/CFSE×100%。

2.8 统计学分析

应用SPSS 25.0进行数据处理，结果均用均数± 标准差表示，多组均数比较在方差齐性时采用方差分析，两两比较采用T检验，应用FlowJo软件分析流式结果，Graphpad prism 5软件作图，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 流式细胞术检测TLR-8 激动剂对调节性T 细胞增殖影响

对照组CD4+CD25+T细胞增殖活性为23.73%±3.36%，TLR-8激动剂组CD4+CD25+T细胞增殖活性为2.95%±1.23%，P＜0.01，差异具有统计学意义，TLR-8激动剂组CD4+CD25+T细胞增殖活性较对照组显著下降，提示TLR-8激动剂明显抑制了CD4+CD25+T细胞的增殖活性。如图1、图2。

图1 对照组和TLR-8 激动剂组 CD4+CD25+ regulatory T 增殖活性比较。结果提示TLR-8 激动剂明显抑制了 CD4+CD25+ regulatory T 的增殖活性，P＜0.01。

图2 对照组和TLR-8 激动剂组 CD4+CD25+ regulatory T 增殖活性比较

3.2 流式检测TLR-8 激动剂通过CD4+CD25+调节性T 细胞对CTL 杀伤CD34+白血病细胞作用的影响

效靶比12.5：1组对照组杀伤率为13.81%±1.77%，TLR-8激动剂组杀伤率为46.98±7.98%，P＜0.01，差异具有统计学意义，效靶比25：1组对照组杀伤率为27.15%±5.99%，TLR-8激动剂组杀伤率为50.88±8.83%，P＜0.01，差异具有统计学意义，TLR-8激动剂组CTL杀伤功能较显著增强，提示TLR-8激动剂明显抑制了CD4+CD25+T细胞免疫抑制功能，进而提高CTL杀伤功能。如图 3、图 4、图 5、图 6、图 7。

图3 空白组

图4 效靶比12.5：1 下，对照组和TLR-8 激动剂组CTLs 的杀伤率比较。结果提示TLR-8 激动剂明显增加了CTLs 的杀伤率，P＜0.05。

图5 效靶比12.5：1 下，对照组和TLR-8 激动剂组CTLs 的杀伤率比较。

图6 效靶比25：1 下，对照组和TLR-8 激动剂组CTLs 的杀伤率比较。结果提示TLR-8 激动剂明显增加了CTLs 的杀伤率，P＜0.05。

图7 效靶比25：1 下，对照组和TLR-8 激动剂组CTLs 的杀伤率比较。

4 讨论

AML占急性白血病的80%，随后发现几乎各类 AML 亚型中都存在 CD34+CD38-的LSC，它们约占整个AML细胞群的0.1%-1%，有学者提出针对 LSC 表面特异性标志物的靶向治疗可选择性清除AML细胞及 LSCs，而不损伤正常造血干/祖细胞[5]，为白血病治疗提供新的思路，拓宽了白血病治疗的途径。

DC是具有强大功能的APC， TLRs在DC、巨噬细胞、中性粒细胞、黏膜上皮细胞和内皮细胞等均有表达，其中TLR-8结合配体后，通过 MyD88 信号通路活化 TLR-8下游分子，如 IRAK、NF-κB、MAPK 等，引起 Th1细胞因子基因表达[6,9]，促进 Th1 细胞因子的分泌。Peng 等[7]研究发现，TLR-8 通过识别配体触发TLR8-MyD88-IRAK4 信号活化途径抑制 Tregs细胞进而抑制肿瘤的发生发展，人们尝试利用免疫佐剂或通过体外培养方法制备DC 疫苗，用于促进 DC 的成熟，增强机体的免疫反应。大量研究证实无论是不成熟的DC还是成熟的DC均可诱导具有抑制功能的CD4+CD25+调节性T细胞的生成。如果在接种负载肿瘤抗原的DC之前，利用抗-CD25抗体去除CD4+CD25+调节性T细胞，则可有效地增强 DC的抗肿瘤免疫应答[8]。有研究表明TLR-8激动剂可直接阻断CD4+CD25+调节性T细胞发挥免疫抑制功能，增强CTL 的抗肿瘤免疫功能[7]。

本研究结果发现在TLR-8激动剂干预下，CD4+CD25+调节性T细胞增殖活性明显下降，在杀伤实验中，CTL杀伤能力明显增强。Ye等学者[10]研究证明肿瘤衍生的内源性cAMP是介导肿瘤诱导T细胞衰老的重要介质，并探讨了TLR-8 配体 poly -G3 预防肿瘤诱导的T细胞衰老的作用是由于降低肿瘤细胞中的cAMP水平，poly- G3处理后肿瘤细胞中的cAMP水平显著降低。Dietsch等研究者[11]利用VTX-2337来刺激THP-1细胞和人PBMC后发现可以增强NK细胞活性，从而增加曲妥单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗等调节的ADCC，并通过 TLR-8 信号通路诱导 IL-1β、IL-18 的分泌。TLR-8激动剂通过结合其配体后介导T细胞衰老并增强体内ADDC。本研究中VTX-2337是通过结合其配体，干预CD4+CD25+调节性T细胞增殖和肿瘤抑制能力，从两个方向增强肿瘤细胞的清除功能，因此认为TLR-8激动剂可作为DC的免疫佐剂，提高体内DC抗肿瘤能力，在今后肿瘤免疫治疗方面有临床应用前景。