人CDK9基因启动子区结合蛋白的生物信息学分析

蔡洁怡，朱其伟，宗陈雨，刘洪鑫，高兢望，王宇蝶，杜冠魁*

（1.海南医学院临床学院，海南 海口 571199；

2.海南医学院基础医学和生命科学学院生化与分子生物学教研室，海南 海口 571199）

细胞周期蛋白依赖激酶（CDKs）不仅可以对细胞周期的进程进行调节，有部分CDKs也可以调控细胞的转录。细胞周期依赖性蛋白激酶9（CDK9）是组成正相转录延伸因子b（P-TEFb）催化活性中心的丝氨酸/苏氨酸激酶[1]。CDK9作为P-TEFb的一部分，通过磷酸化RNA聚合酶II（RNAPII）的CDT第二位丝氨酸，促进转录延伸[2]。在mRNA转录过程中，由于负性转录延伸转录延伸因子（NELF）和DRB敏感诱导因子（DSIF）的阻碍作用，RNAPII在合成一小段mRNA后随即暂停在启动子区[3]，让mRNA拥有足够的时间来实现加帽过程。加帽完成后，CDK9被招募到暂停的转录复合物上，磷酸化NELF的E亚基，DSIF的Spt5亚基[4-5]，解除二者对RNAPII的抑制作用；在此期间，他们为了mRNA的合成能够有效进行，通过在RNAPII的C末端结构域进行磷酸化，继而让RNAPII于暂停点释出。CDK9的活性依赖于与细胞周期调节蛋白亚基（cyclin T1，T2a和T2b）结合，并进一步通过与其他大分子交联进行调节。目前，发现有两种CDK9，分别为42kD和55kD，在不同类型细胞的不同细胞周期中，它们的表达受到调控。发现通过siRNA沉默CDK9的表达，可下调Myc的表达引起的HCC异常增殖，确认了CDK9为治疗HCC的靶标[6]。

1 材料与方法

1.1 人CDK9基因5’调控区序列的获得

在GeneBank上(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)里检测人CDK9 cyclin-dependent kinase 9[Homo sapiens(human)]基因(Gene ID：1025)，把转录起始点作为截取区间，也就是将基因组序列中的上游2000 bp至下游200bp这2200 bp(-2000 bp～+200 bp)当作CDK9基因5’调控区，分析该序列。

1.2 CDK9基因5’调控区序列上转录因子结合位点的预测

使用JASPAR软件(http：//jaspar.genereg.net/)对CDK9基因5’调控区序列上转录因子的结合位点在线分析进行预估，参数设定如下：选取脊椎动物核心数据库(JASPAR Core Vertebrata)，Number of matrices选择200，Type选择Within each matrix，Relative profile score threshold选择85%、90%、95%和100%。

2 结 果

相对剖面分数阈值在85%～100%时，通过在线软件JASPAR在网上对CDK9基因启动子潜在的所测得的转录因子结合位点数依次是2365、686、185和13个。其中Relative profile score threshold在100%的转录因子结果位点如表1所示，包括因子ELK4（ETS-domain protein (SRF accessory protein 1)），Gabpa (GA binding protein transcription factor alpha subunit)，Gata1(GATA binding protein 1)，MZF1(myeloid zinc finger 1)，Pdx1(pancreatic and duodenal homeobox 1)，Prrx2(paired related homeobox 2)，SPI1(Spi-1 proto-oncogene)，ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1)。

表1

3 讨 论

CDK9与Cyclin T1组成异二聚体激酶P-TEFb，于所有的真核生物中都可以检测到。经研究表明：基因转录从起始阶段进入有效延伸阶段需要P-TEFb因子，艾滋病，心肌肥大和肿瘤的发生发展都与其有紧密联系。

到底有哪些转录调控元件能够在CDK9基因的表达调控中产生作用以及产生哪些作用，上调或者下调CDK9基因的表达。在现代分子生物学基因表达调控理论中，我们可以认识到，上调或下调关键决定于有无转录调控蛋白和哪类性质的转录调控蛋白与其互相影响，所以，首要的是找到某些转录文件，在CDK9基因的表达中发挥决定性作用。然而，关于CDK9基因的转录前水平的调控鲜有报道。我们通过生物信息学分析发现CDK9基因启动子上具有多个与转录因子结合的位点，包括因子ELK4，Gabpa，Gata1，MZF1，Pdx1，Prrx2，SPI1，ZEB1。在转录因子ETS家族、三元复合因子(TCF)亚族中，可以检测到ELK4。ELK4通过与ELK1和ELK结合形成三元复合物，发挥调控基因转录的作用[7]。Gabpa是承担与DNA结合任务的GA结合蛋白(GA-binding protein，GABP)NRF-2中的α亚基。NRF-2参与激活线粒体呼吸链蛋白组分的表达，如琥珀酸脱氢酶，细胞色素C，细胞色素C氧化酶，ATP合成酶等；对线粒体复制因子（Replication factor）和转录因子（Transcription factor）的表达进行调节，像人类线粒体转录因子B(mitochondrial transcription factor B，TFBM)；人类蛋白线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)；对线粒体运输蛋白的表达进行调节，如线粒体外膜的移位酶(translocase outer mitochondrial membrane，TOMM)；调节线粒体氧化应激相关蛋白的表达，如参与自由基代谢的Mpv17-like protein，抗氧化蛋白(peroxiredoxins，PRDXs)，DNA修复酶8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶(8-oxoguanine DNA glycosylase，OGG1)。于在早期红系细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、肥大细胞、非造血胚胎干细胞及睾丸基质Sertoli细胞中出现很多GATA。在红细胞增殖、分化过程中，GATA发挥着重要的生物学作用，且跟巨核细胞、肥大细胞和嗜酸性细胞的分化有关。转录因子GATA-1可以和许多生物大分子柜互作用，如红细胞生成素（EPO）、FOG（friend of GATA）、GATA-2等，在thrombocytopenia、MM、Leukocythemia等疾病发病中发挥着重要的生物学效应。Pdx-1是参与包括胰岛素基因在内的多个β细胞特异性基因转录的主控转录因子。生理方面，Pdx-1参与了胰腺的发育和分化，促进胰岛β细胞增殖、成熟和功能的维持[11]；病理方面，除了Pdx-1的基因变异与糖尿病的发生、发展密切相关外，还发现Pdx-1在包括胰腺癌、结肠癌、肺癌和乳腺癌在内的多种肿瘤细胞中呈现过表达，且认为Pdx-1在肿瘤细胞中有促增殖效应，可能与肿瘤的发生、发展、转移及对化疗的耐药有关。SPI1转录因子属于保守的DNA结合蛋白Ets家族中成员之一，因其DNA结合区识别共有序列GAGGAA，故该区又称为Ets结合区。SPI1主要在造血系统如髓细胞和B淋巴细胞中表达，调节关键髓系基因的转录从而调控造血系统的分化。ZEB1是一个转录抑制因子，已被确认为EMT的一个诱导剂。在浸润性实体肿瘤中，ZEB1是一个通过抑制E-钙粘素转录基因编码的EMT关键诱导物。ZEB1在恶性肿瘤的发生、病程进展中起到了推动作用。目前仍需通过大量的实验研究来证实和9深入探讨CDK9基因的表达调控和具体疾病是否存在直接或间接的联系。

CDK9在人类恶性肿瘤细胞中广泛表达，通过抑制CDK9基因的表达，可促进细胞凋亡，可以在肿瘤的治疗中探索出新的治疗手段。根据生物信息学分析发现多个转录因子结合位点位于CDK9基因启动子区，如果我们能够干扰CDK9基因表达的信号转导途径，下调CDK9的表达，也能为抗肿瘤分子靶向药物的进一步发展提供新的方案或治疗靶点。恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的特别重要的一个因素，我们通过研究CDK9的表达作用，可以更好地推动肿瘤治疗方案的改进，从而进一步改善肿瘤患者的预后，更大程度上提高接受治疗后的生活质量。