中华蜜蜂气味受体AcerOr1基因启动子克隆及序列分析

郭丽娜，赵慧婷，任有蛇，徐 兵，姜玉锁

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；3.山西农业大学工学院，山西太谷030801）

中华蜜蜂（Apis cerana cerana）是我国特有的蜜蜂品种，它们善于利用零星蜜粉源，对山区和低温开花植物授粉有着非常重要的作用，而中华蜜蜂的传粉行为与其嗅觉系统中相关蛋白的功能有着密切的关系。其嗅觉感知的起始是由表达在嗅觉受体神经元（ORNs）上的特异性的气味受体识别周围环境中的气味分子并被激活，气味分子与其同源的气味受体Ors匹配激活信号转导级联反应，控制与气味相关动作电位产生的强度和时间。气味受体的一个主要功能是对气味的识别和编码，气味受体具有识别气味分子并将胞外化学信号转换为电信号，并从嗅觉感觉神经元向大脑发送电信号，导致ORNs产生动作电位。有关蜜蜂气味受体的研究，最早是KRIGER等发现的意大利蜜蜂（Apis mellifera）AmelR2[1]，它与果蝇Or83b和冈比亚按蚊AgOr7同源，表达于触角毛型感器和板形感器中。随后从意大利蜜蜂基因组中鉴定出177个Ors[2]，东方蜜蜂（Apis cerana）全基因组测序鉴定出119个Ors[3]。与其他昆虫相比，蜜蜂的气味受体基因数量较多，这与蜜蜂和花之间的化学通讯及蜜蜂群体内化学通讯存在着密切的关系[4]。

赵慧婷[5]在中华蜜蜂中克隆并鉴定出一个传统的气味受体 AcerOr1（GenBank 登录号：JN544932），发现AcerOr1在工蜂和雄蜂不同发育阶段的触角中均有表达，表明AcerOr1可能参与了性别和分工嗅觉感知过程。但是中华蜜蜂AcerOr1基因的表达和分子机制尚不清楚，因此，本研究借助当前基因组学及之前研究提供的数据，对中华蜜蜂AcerOr1基因的启动子结构及其潜在的调控序列进行了分析和推测，为深入研究AcerOr1在中华蜜蜂嗅觉中的功能提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料及试剂

中华蜜蜂（Apis cerana cerana）采集于山西农业大学中蜂实验场。ExTaq DNA聚合酶、限制性内切酶、pMD18－T Vector载体、T4 DNA Polymerase等均购自TaKaRa公司；DNA回收试剂盒购自Axygen公司，Genomic DNAIsolation Kit购自Biovision。

1.2 中华蜜蜂基因组DNA的提取

按照Genomic DNAIsolation Kit说明书提取。

1.3 特异性引物的设计及染色体步移扩增

根据Genebank上中华蜜蜂（Apis cerana cerana）气味受体（odorant receptors）AcerOr1基因cDNA序列（JN544932）分别设计引物 1、2（表 1），与 2 个接头引物AP1、AP2形成巢式引物，进行第1次步移扩增。将得到的目的片段连接到pMD18－T载体上，送去测序。根据第1次扩增的启动子序列，继续设计引物3、4（表1），进行第2次步移并测序。

表1 引物序列

1.4 目的片段回收、片段与载体连接、转化及测序

根据电泳检测扩增结果，使用DNA胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段连接至pMD18－T Vector，并转化E.coli进行鉴定和筛选，将含有目的基因重组子的菌株送至华大基因进行测序。

1.5 生物信息学分析

用DNAMAN等生物学软件对序列进行处理，然后将测序获得的启动子序列提交至http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/、http：//www.cbrc.jp/research/d b/TFSEARCH.HTML进行在线分析，预测启动子序列保守区域中潜在的顺式作用元件。通过McPromote在线工具预测其转录起始位点。用在线工具CpGIsland Searcher（http：//www.usenorris.com/cpgial ands2/cpg.aspx）预测中华蜜蜂AcerOr1基因是否含有CpG岛以及CpG岛位置。

2 结果与分析

2.1 AcerOr1启动子测序及分析

为了判断该产物是否与AcerOr1基因相关，将获得的1 831 bp序列登录NCBI并BLASTn分析，结果发现，该序列的3′端与已有的中华蜜蜂AcerOr1基因序列的5′端部分同源率达到92%，而1 673 bp的5′端序列部分在GenBank数据库中没有同源片段（图1），表明该片段是中华蜜蜂AcerOr1基因5′端的侧翼序列。

用DNAMAN软件将所克隆的中华蜜蜂AcerOr1启动子进行分析。由图1可知，目的片段1 831 bp，去除158 bp重叠序列后，剩余1 673 bp为中华蜜蜂AcerOr1基因启动子区域序列，该序列中碱基A比例为34.2%，碱基T比例为33.7%，碱基C比例为16.7%，碱基G比例为15.4%，AT含量较高，占67.9%；GC含量占32.1%，相差35.8百分点（表2）。通过CpG Island Searcher工具预测，发现扩增的中华蜜蜂AcerOr1基因5'侧翼调控区域没有符合条件的CpG岛，对获得的AcerOr1基因启动子进行转录起始位点预测，在1100～1139bp处存在基础启动子，其序列为：5′-ATTATATAAATATTGCTCGTGGCAA AATGATTCATAAGT-3′。通过McPromote预测中华蜜蜂AcerOr1转录起始位点可能位于翻译起始位点ATG上游621 bp处的碱基T，将此位点标记为＋1，其可能性为0.98（图2）。

表2 中华蜜蜂AcerOr1基因启动子区域碱基组成

2.2 AcerOr1启动子转录因子分析

表3 作用元件种类及功能

在上游正链、下游负链不同的位置上分别有3个TATA-Box和 10个CAAT-Box，3个TATA-Box分别位于上游-292、-880 bp处，下游182 bp。应用在线转录因子结合位点预测程序（Http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.HTML）进一步分析还发现，AcerOr1基因启动子序列中含有众多其他元件，如与环境应激相关的元件热激蛋白因子HSF（AGAAA）；与胚胎发育或组织发育相关的元件：细胞因子CF2-II（TATATATA）、氮调控基因NIT2（TATCAA）、转录激活因子CdxA（ATTTATA）。通过这些作用元件，可以初步认为克隆得到的DNA片段为具有调控功能的启动子序列（图2、表3）。

3 结论与讨论

本研究克隆到的中华蜜蜂组织特异性AcerOr1基因启动子大小为1 673 bp，片段内AT碱基含量较高，占67.9%。真核生物的启动子相对复杂，位于结构基因5′端上游区域，在其指导下RNA聚合酶全酶和模板可以正确的结合并被活化，从而使基因转录启动。典型的真核生物启动子主要包括起始密码子、TATA框、GC框、CAAT框等，其中，起始密码子和TATA框又称为核心启动子，是RNA聚合酶II重要的识别位点，能够使酶准确地识别转录起始位点并开始转录，保证转录得以精确起始[10]，对转录的起始具有重要的作用。本试验获得的中华蜜蜂AcerOr1基因启动子TATA-Box分别位于上游-292、-880 bp处，下游182 bp，符合真核生物5′-TATA[A/T]A[A/T]-3′模式[11]。CAAT-Box与 TATA-Box同样是真核基因启动子上游调控元件，控制着转录的起始频率。本试验10个CAAT-Box表明该序列可能具有较高的启动频率，但是大部分距离转录起始位点较远，能否增强AcerOr1基因的转录效率还有待进一步研究。

生物信息学分析在基因5′端调控区转录子和启动子分析中已经得到广泛的应用[12]。本研究利用启动子在线分析软件，研究了中华蜜蜂气味受体AcerOr1基因5′侧翼区的各种转录因子结合位点，包括与环境应激相关的元件热激蛋白因子HSF（AGAAA）；与胚胎发育或组织发育相关的元件：细胞因子 CF2-II（TATATATA）[6]、氮调控基因 NIT2（TATCAA）、转录激活因子CdxA（ATTTATA）。由以上预测出的与胚胎发育或组织发育和环境应激相关的顺式作用元件，推测可能是一个与生长发育和逆境胁迫有关的启动子。蜜蜂和其他的昆虫一样，属于变温动物，环境温度能直接影响其体温的高低变化和生命过程。sHSPs是昆虫抵御低温损伤的成员之一，研究发现sHSPs基因的表达能提高果蝇在低温环境下的生存率[13]。sHSPs在夜蛾Spodoptera litura和美洲斑潜蝇Liriomyza sativae滞育期表达升高，证明sHSPs与抗低温胁迫有关[14]。sHSPs除了作为分子伴侣保护昆虫在极端低温、氧化、紫外线等不利环境条件下免受组织细胞损伤，还可以参与稳定细胞骨架、保护细胞膜完整性、重组细胞核、抑制细胞凋亡及参与生物体的生长、发育和衰老过程。而热激蛋白基因的表达受蛋白因子HSF的调节。中华蜜蜂嗅觉敏锐，抗寒耐热，善于利用零星蜜粉源，其作为特殊的特种经济动物，近年来备受人们关注。

通过本试验可以初步认为，中华蜜蜂AcerOr1基因的 5′侧翼序列是一个具有 TATA-Box、CAAT-Box的典型真核生物启动子，有一个转录起始位点，通过CAAT-Box控制转录起始频率。AcerOr1基因启动子序列中还含有众多其他元件，如与环境应激相关的元件热激蛋白因子HSF（AGAAA）；与胚胎发育或组织发育相关的元件：细胞因子 CF2-II（TATATATA）、氮调控基因 NIT2（TATCAA）、转录激活因子 CdxA（ATTTATA），表明AcerOr1基因在中华蜜蜂体内的转录和表达可能受到胚胎、组织及外界环境的调控。该启动子的获得，为下一步通过转基因鉴定启动子活性及各种调控元件的作用奠定了基础。