金华猪精液冷冻保存技术研究

章啸君，屠平光，项 云

(金华农业科学研究院，浙江 金华 321007)

1 引言

精液冷冻保存就是利用干冰(-79 ℃)、液氮(-196 ℃)或其它制冷设备作为冷源，将精液经过特殊处理后，保存在极低温度下，完全抑制了精子的代谢活动，使精子的生命在休眠状态下保存下来，升温后复苏而不失去受精能力，使精液达到长期保存的方法。这项技术极大限度的提高了优良种公畜的利用率，减少公畜的饲养量以及疾病的传播，有利于家畜品种的杂交改良，加快遗传进展。1956年，英国人ploge开始研究猪精液冷冻保存技术。在1950～1960期间的研究中，利用牛精液冷冻方法冷冻猪精液，解冻后的精子具有活力，但是没有受精能力[1]。 1970年，Ploge[2]首次报道，用腹腔手术授精法将解冻后的精子直接注入输卵管，获得83%的受精卵，并得到冻精生产的小猪。目前，猪精液冷冻保存技术与其他动物相比，虽然取得了一些进展，但仍然存在着冷冻技术程序复杂、冷冻后效果不稳定等问题。本试验通过对金华猪精液冷冻过程中，不同稀释液、冷冻及解冻方法等各个方面进行研究，从精子活力、畸形率和质膜完整率等方面来综合评价冷冻精液的结果，旨在探索优化出金华猪精液较好的冷冻和解冻方法，为建立实用化的金华猪精液冷冻保存程序提供参考，为今后在金华猪种质资源的保存和利用提供可靠的技术方法。

2 材料与方法

2.1猪精液来源 猪精液采自金华市农业科学研究院金华猪选育场金华猪种公猪。

2.2 主要试剂与仪器葡萄糖、柠檬酸钠、半胱氨酸、Tris等所用试剂均购自Sigma公司,红宝石精子记数板WT-2000C、精子程序冷冻仪与精液质量分析系统均购自北京田园奥瑞公司。

2.3 稀释液配方 3种稀释液分别用10%的柠檬酸钠调节pH值至6.8,抗生素均为青霉素含量为1000 IU/mL、链霉索1000 μg/mL。临用前取冷冻稀释液和新鲜蛋黄二者比例为80%∶20%混合搅拌均匀，冷却至17 ℃备用。3种稀释液组分，见表1。

表1 3种稀释液组分

2.4精液采集 手握法采集金华猪公猪精液中段，经2层精液过滤纸除去杂质，用BTS稀释液在等温条件下按1∶1体积比稀释，2 h内运回实验室，用精液分析仪检测精子的精子活率和畸形率。最后取精子活力在70%以上，畸形率15%以下的精液用于冷冻保存试验。

2.5精液的稀释与平衡 采用二步稀释法，对原精先用不含甘油的稀释液稀释，待温度慢慢降至5 ℃后，平衡1.5 h,再加入含甘油的稀释液，甘油的工作浓度为3%,混匀后立即在低温操作柜中进行0.5 mL细管灌装。

2.6精液的冷冻 方法一:采用程序冷冻仪冷冻，将封好的细管置于程序冷冻仪内(5 ℃)，以5 ℃/min的降温速率，从5 ℃降温至-10 ℃，然后以60 ℃/min的降温速率，从-10 ℃降温至-130 ℃，最后投入液氮保存。方法二：采用液氮熏蒸冷冻法，将细管冷冻架置于装有液氮的冷冻箱内，使细管距液氮面4 cm处，熏蒸10 min后直接投入液氮保存。

2.7精液解冻 从液氮中取出精液细管，在水浴中解冻，轻轻摇动至融化，解冻条件为37 ℃，30 s、45 ℃，20 s、60 ℃，8 s水浴，用剪刀剪开细管两端将精液倒入10 mL装有解冻液试管中混匀。

2.8精液解冻后洗涤 将解冻后的精液放入离心管中，加入3倍量的洗精液，以800转/分钟的速度离心10 min，除去上清液；同样的洗涤重复3次。将洗涤好的精液用洗精液稀释至精子密度在106个/mL左右，在37 ℃平衡30 min后进行精液品质的检查。

2.9精液品质的检查

2.9.1精子活力、畸形率的检查 分别对各试验组冷冻后的精液进行抽样检查，取10 μL精液放在红宝石精子记数板中(37 ℃)，使用精液质量分析系统分析精子活力、畸形率。

2.9.2精子质膜完整性的检测 本试验采用低渗肿胀法[2],用低渗肿胀实验(HOST)测定精子样本的弯尾率即为质膜完整率。将精子样本稀释到1×106个/mL，取500 μL加入1 mL低渗液中,置于37 ℃水浴处理60 min；取5 μL精液滴于载玻片上，加盖玻片后在相差显微镜下计数，至少计数100个精子。

2.10数据处理 应用Graphpad Prism 5软件对数据进行显著性检验，相关数据采用F检验进行统计学处理，P<0.05为存在显著性差异。

3 结果与分析

3.1不同冷冻稀释液效果比较 从试验数据上我们可以看出，Ⅱ、Ⅲ号冷冻稀释液处理组解冻后精子的活力、畸形率和质膜完整性都明显地高于Ⅰ号冷冻稀释液(P<0.05)；Ⅱ号冷冻稀释液和Ⅲ号冷冻稀释液处理组之间没有明显差异(P>0.05)。具体数据见表2。

表2 不同冷冻稀释液效果比较

注：同列标注字母不同的表示差异显著(P<0．05)；同列标注字母相同的表示差异不显著(P>0.05)

3.2不同解冻方法对精子品质的影响 由表3可知，采用60 ℃，8 s方法解冻，精子活力显著高于其他2组(P<0.05)，畸形率显著低于37 ℃，30 s组(P<0.05)，但与45 ℃，20 s组相比差异不显著(P>0.05)。顶体完整率虽高于其他2组，但差异不显著(P>0.05)。具体数据见表3。

表3 不同解冻方法对精子品质的影响

注：同列标注字母不同的表示差异显著(P<0．05)；同列标注字母相同的表示差异不显著(P>0.05)

3.3不同冷冻方法对精子品质的影响 由表4可知，采用程序冷冻仪冷冻法，解冻后精子活力显著优于液氮熏蒸冷冻法组 (P<0．05),畸形率、质膜完整率与液氮熏蒸冷冻法组相比差异不显著(P>0.05)。具体数据见表4。

表4 不同冷冻方法对精子品质的影响

注：同列标注字母不同的表示差异显著(P<0．05)；同列标注字母相同的表示差异不显著(P>0.05)

4 讨论

冷冻稀释液是精子的保护剂，可以减弱精子运动、抑制精子代谢、延长精子体外存活时间，对精液冷冻的效果有重要的影响。本试验比较了几种猪精液冷冻稀释液的冷冻效果，结果发现Ⅱ、Ⅲ号冷冻稀释液处理组解冻后精子的活力、 畸形率和质膜完整率都明显地高于Ⅰ号冷冻稀释液(P<0.05)；Ⅱ号冷冻稀释液和Ⅲ号冷冻稀释液处理组之间没有明显差异(P>0.05)。在Ⅱ、Ⅲ号冷冻稀释液中含有半胱氨酸、BsA和Tris,研究发现半胱氨酸替代部分糖类物质有利于提高精液冷冻的效率。氨基酸在精液冷冻-解冻过程中对精子的保护作用早以引起重视，人们已经发现在羊精子的保护液中加入氨基酸能使精子内部结合比较松的络合物的损失大大降低，其效果比糖类要好[3]。同时，糖类也是保护剂的重要组成部分，它是一种重要的低温保护剂，同时也能够为精子提供能量，低浓度的葡萄糖和乳糖混合使用其冷冻效果将大大提高[4]，与本试验结果基本一致。BSA作为一种大分子蛋白物质，除了可以给精子提供能量外，还可以增加稀释液的粘稠度，使降温过程有所缓和，这符合精液稀释后冷平衡的要求；Tris作为一种良好的缓冲物质，可以使稀释液有一个稳定的pH值，这可能是在精液稀释后冷平衡过程中保持精子活力和质膜完整的一个重要因素[2]。

冷冻到-196 ℃仍存活的精子只有用适宜的解冻方法，才能确保其复活。因为解冻过程中精子要两次经过临界温度区(-60 ℃ 和-15 ℃)。适当的解冻温度能使冷冻的精子快速越过危险温区，使玻璃化快速越过结晶态而直接变为液态，降低对精子的伤害[4]。目前，在大多数猪精液冷冻研究中普遍采用 37 ℃，30 s条件对冷冻精液解冻。本实验对比了 37 ℃，30 s、45 ℃，20 s和60 ℃，8 s,3种温度下的解冻效果，发现60 ℃，8 s解冻更适合于0.5 mL细管的金华猪冻精解冻。采用该优化方案除可获得较高的精子解冻后活力外，质膜完整率 (50.3±3.3)%也较高；精子冻后的畸形率(17.7±1.8)%最低。在一定范围内，随着解冻温度上升，精子的活率和顶体完整率也随之上升。而杜立银[5]等在研究中也发现，高温快速解冻猪冷冻精液的效果好于低温慢速解冻。在猪精液冷冻液中含有大量卵黄、甘油等物质，混合物粘性较大，在低温下融解速度慢，容易形成冰晶伤害精子，而在相对高的温度下，快速解冻可以减少这种伤害[6]。本实验中的解冻液为BTS，pH值为弱碱性，弱碱性能够激活精子的运动性，提高精子活力。但是用碱性稀释液解冻后精子存活时间可能要短一些，因此解冻后要及时输精或者开展别的实验。

本试验同时也对比了不同冷冻方法对精子品质的影响，试验结果表明：采用程序冷冻仪冷冻法，解冻后精子活力显著优于液氮熏蒸冷冻法组 (P<0.05),畸形率、质膜完整率与液氮熏蒸冷冻法组相比差异不显著(P>0.05)。可能主要是由于液氮熏蒸冷冻法距离液氮面距离较近时，使精液温度下降迅速，超过精液承受能力，使解冻后精子活力下降，而如果距离较远，则会使远端精液不能快速冷冻，同样也影响解冻后精子活力下降。

因此采用程序冷冻仪冷冻法，使用Ⅲ号冷冻稀释液，在60 ℃，8 s水浴解冻方法更为适合0.5 mL细管金华猪冻精冷冻保存及解冻。通过本试验能够为金华猪精液的冷冻技术提供理论支持，为今后在金华猪的种质资源保存利用提供可靠的技术方法。