臭氧对大鼠角膜碱烧伤后氧化应激损伤的抑制效应＊

夏清平，孙小彤，袁嘉喆，徐 超，邓 丽

眼角膜碱烧伤是常见的眼外伤之一，在化学烧伤中占比最高，通常是由特殊的职业或行为引起，高致残率严重影响患者的生活质量［1］，早期有效的治疗对于恢复视功能和减少并发症非常重要。目前临床针对角膜碱烧伤的早期治疗主要以清水或生理盐水冲洗、激素以及各种修复功能的滴眼液为主，效果有一定的局限性，如何进一步提高治疗效果是临床上迫切需要解决的问题［2］。

臭氧是一种超活性氧，由于其强大的氧化性、氧溶解性和杀菌特性，近年来在临床上备受重视。研究证实［3］，臭氧水溶液对兔眼烟曲霉菌性角膜溃疡具有很好的抗菌治疗效果，与氟康唑滴眼液的比较，疗效相似且具有天然不耐药、成本低等优势。肖彩雯等［4］通过体外灭菌实验研究进一步证实了臭氧生理盐水对真菌性角膜炎的治疗效果，并确定了最佳臭氧溶液治疗浓度。笔者通过建立大鼠角膜碱烧伤模型，验证臭氧可以减轻氧化应激反应并观察有效的治疗浓度，为临床治疗角膜碱烧伤提供新的诊疗思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型制备 SPF级健康SD雌性大鼠30只（体重250～300 g，由牡丹江医学院医药研究中心动物房提供）随机分为空白对照组、模型组、低浓度（2 mg/L）臭氧治疗组，中浓度（3 mg/L）臭氧治疗组，高浓度（4 mg/L）臭氧治疗组，每组6只。大鼠碱烧伤模型制备：以4 ml/kg的剂量使用10%水合氯醛溶液腹腔注射大鼠，进行麻醉。剪切直径为3.0 mm的圆形滤纸，在1 mol/L NaOH溶液中浸泡60 s，并用其他滤纸将多余液体吸干后，迅速将其附着于角膜表面中央45 s，随后快速使用生理盐水于结膜囊冲洗70 s。在角膜中央可以看到灰白色的灼烧区域，呈圆形，大小相同表示建模成功。治疗方案：碱烧伤模型组滴眼生理盐水，3滴/次，3次/d，连续7 d。将不同浓度的臭氧溶解到灭菌注射用水中，制备成低浓度组（2 mg/L），中浓度组（3 mg/L），高浓度组（4 mg/L），滴眼3次/d，滴注方式同上。治疗第7天后，处死大鼠、取材一部分置于EP管中，并储存于-80℃冰箱中备用（ELISA法测SOD/MDA）。

1.2 形态学观察 用裂隙灯显微镜（SLM2型，重庆康华）分别在碱烧伤后第1、3、7天对大鼠眼角膜观察角膜溶解 （使用Pfister评分标准）［5］、角膜混浊（Holland评分标准）程度［6］。计算角膜新生血管长度及面积，公式：S=C/12×3.1416［r2（r-l）2］，C 为角膜血管网所占的圆周数，l为新生血管的生长长度，r为角膜半径。

1.3 SOD/MDA的检测方法 使用SOD/MDA ELISA试剂盒（南京建成生物），使用硫代巴比妥法测定样本中MDA的含量。SOD试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人超氧化物歧化酶（SOD）水平。具体步骤参照试剂说明书。

1.4 统计学处理 用SPSS 11.0统计软件进行SOD、MDA 数据处理。 计量资料以（x±s）表示，采用单因素方差分析的方法，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 臭氧对大鼠眼角膜碱烧伤后的治疗作用 臭氧水可以有效降低角膜溶解面积、减轻角膜混浊度、抑制角膜新生血管面积、促进角膜恢复。与模型组相比，臭氧治疗组（高、中、低剂量组）术后7 d与术后1 d相比角膜溶解面积、角膜混浊度明显减少，角膜新生血管面积明显降低，其中，中浓度组（3 mg/L）效果最为明显（P＜0.01）。 见表 1。

2.2 臭氧对大鼠眼角膜碱烧伤后氧化应激的抑制作用 角膜碱烧伤后，与对照组相比MDA含量明显增加，SOD活力明显降低（P＜0.05）。经过臭氧治疗后明显降低角膜的氧化应激反应。与模型组相比，中剂量治疗组明显降低角膜组织中 MDA的表达（P＜0.05），增加 SOD 含量的表达（P＜0.05）。 见表2。

3 讨论

人体除眼角膜外，其他部位的氧供大部分来自于呼吸系统，而眼角膜的氧供80%是通过与外界空气接触而获得，15%来自于角膜缘血管，5%来自房水［7］。空气和睑结膜血管提供的氧通过泪液传递给角膜。当角膜碱烧伤后，角膜组织恢复过程中对氧的需求增加，但目前临床上使用的眼部治疗用品，多以抗炎、促修复为主，缺少直接释氧、供氧的治疗方法。臭氧（O3）由3个氧原子组成，是氧气的同素异形体，氧化性更强、水溶性更高，溶解度是普通氧气的10倍，更易溶于血液和组织液，增加游离氧的含量，提供更充足的氧化作用和氧饱和作用。常温常压下，其稳定性较差，半衰期仅为30～60 min，可自行分解为氧气并同时释放一些能量，有利于补充细胞的能量供给，提高细胞的代谢能力［8，9］。 臭氧溶于水增加了溶解氧的含量，直接作用于组织表面，有利于受损组织细胞摄取氧、促进组织修复［10］，该实验通过镜下观察角膜组织证实臭氧水可以有效降低角膜溶解面积、减轻角膜混浊度、抑制角膜新生血管面积，促进角膜恢复。通过对不同治疗浓度的比对，笔者发现中等剂量（3 mg/L）的臭氧水治疗效果最好。

表1 不同浓度的臭氧对大鼠角膜碱烧伤后的治疗作用

表2 不同浓度臭氧对碱烧伤眼角膜组织中MDA/SOD含量表达的影响（x±s）

臭氧本身是一种强氧化剂，文献报道［11］适当的臭氧刺激可以诱导体内抗氧化反应增强，清除过多的氧自由基，降低炎性反应，继而减轻氧化应激反应。其主要机制［12］是通过增强丙酮酸盐的氧化羧基化作用，提高细胞内ATP和2，3-DPG水平，激活三羧酸循环，增加多种氧自由基清除酶的生成，例如谷胱甘肽过氧化氢酶 （GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）等。通过测定SOD活性和MDA的含量证实了臭氧可以降低角膜碱烧伤后引发的氧化应激损伤，这可能是臭氧促进角膜恢复的机制的之一。臭氧由于是一种氧化剂，相比传统的生理盐水、激素以及各种抗生素药水而言是一种天然不耐药的抗生素，具有无依赖性、价格低廉、使用方便等诸多优势。

由于该实验的设计初衷是证实臭氧治疗降低氧化应激损伤的有效性，因此仅观察了术后7 d的角膜恢复情况，计划在以后的实验中延长观察时间或增加组织形态学的检测，以进一步证实结论。