不同程度宫颈癌前病变患者阴道菌群的群落差异分析

刘 星

宫颈癌为我国女性较为常见的恶性肿瘤，其发病率在所有女性恶性肿瘤中位居第二，在生殖系统恶性肿瘤中位居首位，随着人们生活方式及生活环境的不断改变，宫颈癌的发病率正呈逐年升高趋势，严重威胁女性生命健康［1，2］。 宫颈癌前病变（cervical intraeptithelial neoplasia，CIN）主要是指女性具有癌变风险，但临床尚未诊断为原位癌的一类宫颈异常增殖性病变，极有可能发展为宫颈癌［3］。众所周知，女性阴道菌群在阴道微环境稳定保护过程中起着至关重要的作用，越来越多的学者认为，阴道微生物可能在宫颈病变发生过程中发挥着关键性作用［4］。然而，上述观点尚存在一定的争议，既往研究中主要是依靠采集女性阴道分泌物涂片与阴道功能性指标等途径评价阴道微生态，然而实际工作中受多种因素的影响，可能会对实际结果产生影响。鉴于此，该文通过对比不同程度宫颈癌前病变患者阴道菌群群落差异，旨在为临床宫颈癌前病变的防治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取笔者所在医院2017年2月—2019年2月收治的宫颈癌前病变患者117例作为研究对象。年龄 23～58 岁，平均（39.84±5.22）岁；文化程度：初中及初中以下50例，高中及高中以上67例。将其按照患者宫颈癌前病变程度的差异分成CINⅠ组39例、CINⅡ组34例以及CINⅢ组44例。另取同期接受体检的健康女性40名作为对照组，年龄 24～59 岁，平均（39.88±5.25）岁；文化程度：初中及初中以下16例，高中及高中以上24例。两组上述指标比较，差异不显著（P＞0.05），均衡可比。纳入标准：（1）宫颈癌前病变患者均与《宫颈癌前病变以及宫颈癌检查教程》［5］中所制定的相关诊断标准相符；（2）均为已婚女性；（3）入院前 1个月内为接受抗生素以及阴道冲洗药物干预；（4）年龄≥18周岁。排除标准：（1）近1周内有性生活、阴道异常分泌物以及流血者；（2）合并泌尿生殖器炎症者；（3）心、肝、肾等重要脏器发生病变者；（4）具有长期使用皮质类固醇以及免疫抑制剂史者；（5）意识障碍或伴有精神疾病者；（6）正参与其他研究者。研究对象知情同意，且医院伦理委员会已批准该研究。

1.2 研究方法 （1）以无菌棉拭子在所有受试者阴道后穹窿处转动15 s左右，待其充分吸收受试者阴道内分泌物后置入干燥无菌试管内，将采集好的标本放置在冰箱中保存，用于细菌基因组提取。细菌基因DNA提取试剂盒购自德国，具体操作严格按试剂盒说明书进行。以稀释提取的基因组作为模板，引物序列如下：5’-ACTCCTACGGGAGGCAG GAG-3’，5’ -GGACTACHVGGTWTCATAAT-3’。PCR产物以琼脂糖凝胶实施电泳检测，并按照其PCR产物浓度予以等量混合。生物信息学分析以MiSeq软件的默认指数对其原始测序数据予以测定，在去除接头数列以及低质量数列的预处理，通过其命令对标本菌群的主成分分析和不同组件群落结构以及菌群差异。（2）血清炎症因子水平检测：分别于所有受试者清晨空腹状态下，采集静脉血5 ml，以3000 r/min作为离心条件进行时长为10 min的离心处理，取上层血清保存在-80℃冰箱中待检。检测方式为酶联免疫吸附法，具体操作严格遵从试剂盒说明书进行，相关试剂盒均购自上海康郎生物科技有限公司。

1.3 观察指标 比较四组人员多样性指数，阴道菌群类型，阴道菌群检出情况，血清炎症因子水平。

1.4 统计学方法 以SPSS 20.0软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，计数资料以［n（%）］表示。

2 结果

2.1 四组人员多样性指数对比 CINⅠ组Chao指数、ACE指数相较于CINⅡ组、CINⅢ组、对照组明显更高（P＜0.05）；而四组在辛普森指数、香农指数方面比较，差异无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 四组人员多样性指数对比（x±s）

2.2 四组阴道菌群类型对比 CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组、对照组的阴道菌群类型比较，差异无统计学意义，见表2。

表2 四组阴道菌群类型对比［例（%）］

2.3 四组阴道菌群检出情况对比 CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组乳酸杆菌检出率均显著低于对照组，且CINⅡ组、CINⅢ组解脲支原体、衣原体检出率亦显著高于对照组；四组霉菌以及滴虫检出率对比差异均不明显，见表3。

表3 四组阴道菌群检出情况对比［例（%）］

2.4 四组血清炎症因子水平对比 CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组血清IL-2水平均显著低于对照组，IL-4水平显著高于对照组，且CINⅡ组、CINⅢ组血清IFN-γ水平显著低于对照组，见表4。

表4 四组血清炎症因子水平对比（例，x±s）

3 讨论

阴道微生态环境主要是由内分泌调节、微生态菌群、解剖结构组成，相关研究表明，每个育龄女性可分离6～8种微生物，且以细菌为主，并会随着年龄以及妊娠等变化随之发生演变［6-8］。作为一种生物屏障，阴道菌群存在于阴道黏膜上皮以及阴道分泌液中，可发挥防御外袭菌侵入，激活宿主免疫反应以及维持阴道环境等多种功效［9］。宫颈暴露在阴道中，正常情况下阴道微环境处于平衡状态，一旦该平衡被打破，则会促使微生物入侵，继而引发宫颈病变，对女性的生命健康安全造成严重威胁［10］。

该文结果显示，CINⅠ组Chao指数、ACE指数相较于CINⅡ组、CINⅢ组、对照组明显更高；而四组在辛普森指数、香农指数方面对比均不明显，说明了CINⅠ患者相较于健康女性，其阴道部分菌群丰度增加。此外，CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组乳酸杆菌检出率均显著低于对照组，且CINⅡ组、CINⅢ组解脲支原体、衣原体检出率亦显著高于对照组。这在韩华等人的研究中得以证实［11］：CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组以及宫颈癌组的乳酸杆菌检出率均显著低于对照组。究其原因，解脲支原体是人乳头瘤病毒促进宫颈病变的重要辅助因子，和人乳头瘤病毒的持续感染以及宫颈早期细胞学改变存在密切相关。而衣原体的代谢产物可促使宫颈局部出现pH值的升高，进一步对阴道局部免疫保护屏障造成破坏，继而增加了人乳头瘤病毒的易感性，最终促进了宫颈病变的发生、发展。正常而言，女性阴道菌群中主要以乳酸杆菌为主，其在保护女性阴道微生态平衡以及抑制病原微生物生长，提高女性阴道局部抗感染以及抗肿瘤能力方面具有极其重要的作用。乳酸杆菌可保护女性阴道黏膜上皮细胞不会遭受病原菌侵害，同时分泌出相应的物质促进生物膜的形成，继而发挥抑制病原菌黏附和侵袭的作用。而随着乳酸杆菌的下降，会导致女性阴道微生态平衡破坏，宫颈上皮对高危型人乳头瘤病毒的易感性提高，从而促进了宫颈病变的发生、发展。IFN-γ主要是活化的Th细胞以及NK细胞合成、分泌，促进Th1细胞的发育成熟，同时对Th2细胞的活化产生抑制作用，参与免疫调节过程。IL-2则是机体免疫应答核心因子之一，其活性高低和宫颈局部免疫状态直接相关，随着IL-2表达的增多可提高巨噬细胞的抗肿瘤活性。而IL-4主要是由激活的Th2细胞分泌，可促使Th细胞朝着Th2细胞方面分化，具有抑制杀伤细胞激活的功能［12］。而该文结果发现了CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组血清IL-2水平均显著低于对照组，IL-4水平显著高于对照组，且CINⅡ组、CINⅢ组血清IFN-γ水平显著低于对照组（均 P＜0.05）。 这提示了炎性因子 IFN-γ、IL-2 以及IL-4可能是宫颈癌前病变的影响因子，可能通过参与宫颈癌前病变的发生、发展过程［13-15］。

综上所述，不同程度宫颈癌前病变的患者阴道菌群多样性以及类型均和健康女性差异不大，仅CINⅠ患者的阴道部分菌群丰度增加。而解脲支原体、衣原体增加与乳酸杆菌减少以及血清IFN-γ、IL-2、IL-4水平异常改变，可能在宫颈癌前病变的发生、发展过程中起着至关重要的作用。