参七虫草胶囊干预肺间质纤维化大鼠模型PI3K/Akt信号通路实验研究

董 梅，张念志，陈 炜，纪 娟，倪 兴

(1.安徽中医药大学第一附属医院呼吸内科，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学第二附属医院呼吸内科，安徽 合肥 230061)

参七虫草胶囊是安徽中医药大学第一附属医院呼吸内科在总结多年临床实践经验基础上研制的院内制剂，治疗肺部疾病(如肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病)具有显著临床疗效[1]。为进一步探讨参七虫草胶囊治疗肺间质纤维化的作用靶点，笔者观察了其对肺间质纤维化模型大鼠外周血及肺组织中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine protein kinase B，Akt)含量的影响，为临床应用参七虫草胶囊治疗肺间质纤维化提供实验依据。

1 材料

1.1 药物 参七虫草胶囊由安徽中医药大学第一附属医院制剂室提供，药物组成为西洋参、三七和冬虫夏草。

1.2 实验动物和分组 40只清洁级SD大鼠，由江苏省常州卡文思实验动物有限公司[动物生产许可证号：SCXK(苏)2016-0010]提供，体质量为(200±25)g，适应性饲养1周。动物饲养室为清洁级，室温控制在(24±2)℃。

1.3 实验药物和试剂 泼尼松(产品批号：1701021)：西安利君制药有限责任公司；参七虫草胶囊(产品批号：20170016)：安徽中医药大学第一附属医院制剂中心；博莱霉素注射液(产品批号：322C022)：北京索莱宝；大鼠Akt试剂盒(产品批号：Q23013186)、PI3K试剂盒(产品批号：Q25013187)：武汉华美生物工程有限公司。

1.4 主要仪器 TGL-16C台式离心机：安徽嘉文；AJC-0501-P纯水仪：上海力康；TL-420D水浴锅：常州奥华；DNP-9056BS-Ⅲ电热恒温箱：上海三发；EPOCH酶标仪：深圳雷杜；WH-4微型旋涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造公司。

2 方法

2.1 模型复制和给药方法 大鼠适应性饲养1周后，将其随机分为4组：空白对照组、模型组、参七虫草胶囊组、氢化泼尼松组，每组10只。采用博莱霉素气道喷雾复制肺纤维化大鼠模型[2]，应用10%水合氯醛，按照3.5 mL/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠后，将光源直接照射于大鼠咽喉部黏膜，一手戴手套提起舌头向外向上，暴露会厌，在舌根和会厌交界区，显露出声门，将雾化器的喷雾头经声门裂轻轻插入气管内，予博莱霉素5 mg/kg雾化给药复制模型。4组均于模型复制成功后第2天灌胃，空白对照组和模型组每日给予生理盐水10 mL/kg灌胃，羟化泼尼松组每日给予羟化泼尼松6 mg/kg灌胃，参七虫草胶囊组每日给予参七虫草胶囊0.35 g/kg灌胃，疗程均为28 d。

2.2 指标观察方法

2.2.1 肺组织观察 按照3.5 mL/kg剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠后，分离腹主动脉，即刻取血3.0 mL，离心(3 000～4 000 r/min)15 min，及时取上清，置4 ℃冰箱保存待检，取左肺上叶肺组织，分为两部分，其中一部分采用4%甲醛固定1 d后，石蜡包埋，按照4 μm厚度连续组织切片，行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色，光镜下观察肺组织病理图片。另一部分肺组织，用9倍匀浆介质研磨，然后将研磨液3 000～4 000 r/min，离心10 min，取上清制备成10%的组织匀浆，置于4 ℃冰箱保存待检。

2.2.2 Akt和PI3K水平检测 酶联免疫吸附试验检测治疗前后大鼠肺组织中Akt和PI3K的水平。将大鼠抗Akt、PI3K单克隆抗体包被于酶标板上，标品和样品中Akt、PI3K与单抗体结合，链霉素-辣根过氧化物酶受体与加入生物素的抗大鼠Akt、PI3K抗体结合，形成粘附在酶标板上的免疫复合物，未结合的酶通过温浴和洗涤方法除去，将底物A、B加入标本中，显示蓝色，终止液酸被加入后，蓝色转变为黄色，样品中Akt、PI3K的浓度与黄色的深浅呈正相关，肺组织中大鼠Akt、PI3K水平通过绘制标准曲线计算。

3 结果

3.1 各组大鼠血清及肺组织中Akt、PI3K水平比较 与空白对照组比较，模型组大鼠血清和肺组织中Akt及PI3K水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，参七虫草胶囊组和氢化泼尼松组血清及肺组织中Akt及PI3K水平显著降低(P<0.05)；参七虫草胶囊组大鼠血清和肺组织中Akt、PI3K水平显著低于氢化泼尼松组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清及肺组织Akt、PI3K水平比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与氢化泼尼松组比较，△P<0.05

3.2 4组大鼠肺泡上皮细胞及间质的组织形态学变化比较 光镜下观察发现，空白对照组大鼠肺泡壁上皮细胞形态及数量正常，肺泡间隔形态正常，纤细均匀；模型组大鼠肺泡壁上皮细胞形态杂乱不规则，数量减少，肺泡间隔增厚，间距增大，间质增生；氢化泼尼松组及参七虫草胶囊组大鼠肺泡壁上皮细胞形态杂乱，数量较模型组有所增多，肺泡间隔较模型组减小，间质减少。见图1。

注：A.空白对照组；B.模型组；C.氢化泼尼松组；D.参七虫草胶囊组

图1 4组大鼠肺泡上皮细胞及间质的组织形态学变化比较(HE染色，10×20倍)

4 讨论

特发性肺间质纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)近年来发病率日渐增高,发病人群以中老年人常见[3]，主要累及肺间质、肺泡和(或)细支气管等部位，是一种病因不明的慢性炎症性间质性肺疾病，由于临床疗效不佳，相关研究逐渐增多。

在肺间质纤维化病理过程中，肺成纤维细胞(lung fibroblast，LF)和肺肌成纤维细胞抗凋亡能力增强，这两类细胞的持续存在导致肺间质纤维化发展[4]。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)、转移生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、胰岛素样生长因子-1等诸多细胞因子可通过激活PI3K/Akt信号途径使LF具有抗凋亡的能力[5]，研究证明，当受到细胞凋亡的刺激，细胞内活化的PI3K及Akt信号能保护细胞免于凋亡。

广谱抑制剂LY294002可抑制PI3K/Akt等多种信号通路，可完全阻断TGF-β诱导体外培养的人LF纤维化的发生[6]。PI3K/Akt信号激活后，导致TGF-β1下游Smad3蛋白的转录活性进一步增强，继而成纤维细胞表达Ⅰ型胶原蛋白过程持续活化。LF表面的血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)受体由TGF-β1介导的Smad、P38MAPK、JNK、PI3K/Akt等通路信号所活化，AngⅡ与其受体结合后促进LF分泌细胞外基质。由此可见，PI3K/Akt信号与TGF-β1因子协同作用而参与肺纤维化病程，提示PI3K/Akt信号在IPF的发生发展中起着重要作用。

肺纤维化在病机方面多表现为本虚标实：标实表现为肺纤维化有瘀血阻络；本虚表现在早期为上焦肺虚，病程迁延日久则累及下焦肾脏，耗伤气阴，后期则肺肾气阴两虚[7]。参七虫草胶囊是安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，由西洋参、三七、冬虫夏草三味名贵中草药组成。西洋参具有补肺益气养阴功效，作为君药；臣药冬虫夏草具补益肺肾之精作用；三七活血散瘀，为佐药。三药合用，具有益肺补肾、养阴益气、活血散瘀之功效，祛邪而不损伤正气，补虚而不留邪毒。全方配伍严谨，标本同治，临床疗效显著。

课题组前期研究结果表明，在博莱霉素诱导肺纤维化大鼠模型实验中，参七虫草胶囊抑制肺纤维化早期肺泡的炎症反应与其降低肺组织基质金属蛋白酶9及基质金属蛋白酶抑制剂-1表达密切相关[8]。与氢化泼尼松比较，参七虫草胶囊能显著抑制肺纤维化患者骨桥蛋白表达[9]。降低白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)，升高γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)，纠正IFN-γ/IL-4失衡[10]。参七虫草胶囊降低肺纤维化大鼠肺组织上皮细胞钙黏素(E-cadherin，E-cad)，升高α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)以及波形蛋白，从而抑制肺泡上皮细胞转化[11]。笔者在既往研究的基础上，研究参七虫草胶囊对肺纤维化模型大鼠外周血及肺组织中PI3K/Akt信号通路的影响，为参七虫草胶囊临床防治肺纤维化提供实验依据。

本实验结果显示，肺纤维化模型组大鼠血清及肺组织PI3K、Akt水平均明显升高，而参七虫草胶囊可显著改善血清及肺组织PI3K、Akt水平，表明其延缓肺间质纤维化的机制可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活，减轻肺纤维化炎症反应而实现的。