云南小麦品种(系)株高和粒重相关功能基因的KASP标记检测

(云南省农业科学院粮食作物研究所/国家小麦改良中心云南分中心，昆明 650200)

小麦是我国三大主要口粮作物之一，其产量高低直接关系到国家的粮食安全，并在人们的膳食结构中具有重要地位。提高小麦产量一直是小麦育种者的首要目标。而株高是小麦重要的农艺性状，对产量具有重要影响。随着育种中矮秆基因的广泛应用，矮秆和半矮秆小麦品种的育成和推广对全球小麦株高的降低和产量的提高起了十分关键的作用[1]。小麦的株高性状受多个基因控制，其中来自农林10号的Rht-B1b、Rht-D1b和赤小麦的Rht8是小麦育种和生产中常见基因[2-4]。千粒重作为小麦产量构成三要素之一，研究表明，千粒重与产量呈极显著正相关关系[1,5-7]。现已发现了多个控制小麦千粒重的基因位点，如TaCwi-A1、TaGW2-6A与TaSus2-2B等产量相关基因对小麦千粒重、粒宽等性状均具有调控作用，可直接影响小麦产量的高低[8-10]。因此，研究上述小麦株高和千粒重相关功能基因的分布，对于提高产量潜力和改良株高具有重要作用。

分子标记已广泛应用于上述小麦株高和千粒重相关功能基因的检测鉴定。在矮秆基因方面，已开发了可准确鉴定Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8等基因的功能标记[11,12]，国内多位学者利用这些功能标记分别对我国不同麦区矮秆基因的分布情况进行了研究[13-18]。在千粒重相关基因方面，已开发出粒重相关基因TaGW2-6A、TaCwi-A1和TaSus2-2B等的功能标记[8-10]，多位学者已分别对TaGW2-6A、TaCwi-A1、TaSus2-2B基因位点的功能标记在不同材料中进行了标记检测和实用性验证[19-25]。

KASP(Kompetitive allele specific PCR)技术，即竞争性等位基因特异性PCR技术，具有高度稳定性、准确性和低成本的特点，目前已经被广泛应用于高通量SNP分型以及InDels检测[26]。Rasheed等[27]、Khalid等[28]利用这一简便高效的技术，开发了矮秆基因Rht-B1、Rht-D1和千粒重功能基因TaSus2-2B、TaCwi-A1、TaGW2-6A的KASP标记，能实现基因的快速准确检测，并利用多份小麦材料进行了验证。云南地处云贵高原，具有独特立体生态气候，小麦产量水平低，产量性状一直是云南小麦遗传改良的重要目标。研究云南小麦株高和千粒重相关功能基因分布及其基因组成，对该地区小麦产量相关性状遗传改良具有重要意义。但迄今未有株高和粒重相关基因的功能标记对云南小麦品种(系)进行标记检测的研究报道，制约了云南小麦产量性状遗传改良工作的开展。本研究利用矮秆基因Rht-B1、Rht-D1的KASP标记Rht-B1_SNP、Rht-B1_160IND、Rht-B1_197IND、Rht-D1_SNP和千粒重相关功能基因TaCwi-A1、TaGW2-6A、TaSus2-2B的KASP标记TaCwi、TaGW2-6A、TaSus2-2B_SNP，对42份云南省育成小麦品种(系)进行基因单倍型检测鉴定，旨在了解云南小麦品种(系)中株高和千粒重相关功能基因的分布状况，筛选含有目标基因的优异小麦种质，为云南省小麦产量相关性状的遗传改良提供材料和方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究所用材料为42份云南育成小麦品种和育成高代品系，供试材料分别由云南省内相关育种单位选育。供试材料详见表1。

1.2 基因组DNA提取

每份材料取8～10粒种子置于铺有滤纸的培养皿室温下培养，萌发后7 d取幼苗叶片，用CTAB法[29]提取基因组DNA。

1.3 KASP标记检测

供试材料的KASP标记检测由中国农业科学院作物科学研究所何中虎老师课题组进行。试验所用2个矮秆基因和3个千粒重基因的KASP标记引物来源于Rasheed等[27]设计或Khalid等[28]报道，引物序列详见表2。PCR反应体系为10μL，包括4.78μL DNA(5～50 ng·μL-1)，5μL KASP MasterMix(LGC公司，英国)，0.14μL KASP Assay Mix，0.08μL Mg2+。KASP Assay Mix由3条引物稀释获得，按FAM-引物(100μmol·L-1)∶HEX-引物(100μmol·L-1)∶通用引物(100μmol·L-1)∶ddH2O=12∶12∶30∶46的比例混合而成。PCR反应在Bio-Rad CFX 96 PCR仪上(Bio-Rad，美国)上进行。每次反应设置空白对照组，其DNA模板用ddH2O代替。PCR反应程序为：95 ℃热处理15 min；95 ℃变性20 s，65～55 ℃退火和延伸25 s，10个循环(每循环降低1.0 ℃)；95 ℃变性10 s，57 ℃退火和延伸1 min，30个循环；4 ℃避光保存。反应结束后进行荧光扫描，并作基因分型分析。

2 结果与分析

2.1 株高矮秆基因Rht-B1和Rht-D1的KASP标记检测

利用Rht-B1_SNP、Rht-B1_160IND、Rht-B1_197IND标记和Rht-D1_SNP标记分别对42份供试品种(系)株高矮秆基因Rht-B1和Rht-D1进行检测，标记的基因分型结果和频率分布结果分别列于表1和表3。结果表明，15份品种(系)为Rht-B1基因的矮秆基因单倍型Rht-B1b/Rht-B1a+197 bp，频率为35.71%；11份品种(系)为Rht-D1基因的矮秆基因单倍型Rht-D1b，频率为26.19%。基因型组合分析发现，42份供试材料中共有5种株高矮秆基因型组合，其中17份品种(系)为Rht-B1a/Rht-D1a单倍型组合，频率为40.48%；10份品种(系)为Rht-B1a/Rht-D1b单倍型组合，频率为23.81%；2份品种(系)云麦51和云麦73为Rht-B1a+197bp/Rht-D1a单倍型组合，频率为4.76%；12份品种(系)为Rht-B1b/Rht-D1a单倍型组合，频率为28.57%；1份品种(系)云麦53为Rht-B1b/Rht-D1b单倍型组合，频率为2.38%。

表1 42份云南小麦株高和千粒重的KASP标记基因分型

注：N表示无检测信号。

表2 矮秆和千粒重相关功能基因的KASP标记引物

注：波浪线标注序列为FAM标签序列，下划线标注序列为HEX标签序列。

表3 42份云南小麦中株高和千粒重相关功能基因的分布频率

2.2 千粒重基因TaCwi-A1、TaGW2-6A和TaSus2-2B的KASP标记检测

利用TaCwi标记、TaGW2-6A标记和TaSus2-2B_SNP标记分别对42份供试品种千粒重相关功能基因TaCwi-A1、TaGW2-6A和TaSus2-2B进行检测，标记的基因分型结果和频率分布结果分别列于表2和表3。结果表明，18份品种(系)为TaCwi-A1基因的高千粒重单倍型TaCwi-A1a，频率为42.86%；16份品种(系)为TaGW2-6A基因的高千粒重单倍型Hap-6A-A，频率为38.10%；30份品种(系)为TaSus2-2B基因的高千粒重单倍型Hap-H，频率为71.43%。基因型组合分析发现，聚合3个千粒重基因高粒重单倍型(TaCwi-A1a/Hap-6A-A/Hap-H)的小麦品种(系)有5份，分别是云麦76、云麦78、云154-65、文D6-8、靖麦12，频率为11.90%；聚合3个千粒重基因低粒重单倍型(TaCwi-A1b/Hap-6A-G/Hap-L)的小麦品种(系)有7份，分别是云麦39、云麦54、云麦69、云麦72、云麦73，云16D4-13、凤麦38，频率为16.67%。

3 讨 论

随着高通量测序技术的发展，KASP检测、育种芯片等分子育种技术逐渐被育种家采用。利用简便高效的高通量KASP检测技术，在小麦上已开发了120余个能有效鉴定80余个小麦产量、品质、抗性和适应性相关基因的高通量KASP功能标记，为小麦重要性状功能基因的快速检测提供了新的检测方法[27-28,30]。国内学者分别利用KASP功能标记对不同类型小麦品种的产量、品质、抗性和适应性相关基因进行检测分析，认为KASP标记辅助选择能显著地提高小麦育种效率[31-33]。本研究利用株高矮秆基因Rht-B1、Rht-D1的KASP标记和千粒重相关功能基因TaCwi-A1、TaGW2-6A、TaSus2-2B的KASP标记准确、快速地鉴定出上述功能基因在云南小麦品种(系)中的分布状况，为云南省小麦产量相关性状的遗传改良提供了材料和方法。

矮化是小麦高产育种的重要途径，株高的降低有助于提高抗倒性和收获指数，实现产量潜力提升[1]。控制小麦株高的矮秆基因很多，其中来自农林10号的Rht-B1b、Rht-D1b和赤小麦的Rht8等3个基因是小麦育种和生产中利用最普遍的矮秆基因[2-4]。本研究中，Rht-B1b在供试材料中的分布频率(35.71%)大于Rht-D1b(26.19%)，这与前人研究结果[13,15,16,31]不一致。不同麦区的气候地理条件、育种中所选用的亲本材料不同可能是造成矮秆基因频率不同的原因。通过本研究发现部分品种的实际株高与基因检测结果并不十分吻合，如云麦78、靖麦74和宜麦3号等生产中平均株高低于80 cm，比大部分含有矮秆基因的小麦品种平均株高还低，但基因型检测为Rht-B1a/Rht-D1a野生单倍型组合。其原因可能在于这些品种可能含有尚未检出的其他矮秆基因，这有待继续进行深入研究。

提高小麦千粒重是提高产量的重要途径之一[1]，但千粒重是受多个微效基因控制的数量性状，在常规育种表型选择中存在较大的困难。TaCwi-A1、TaGW2-6A与TaSus2-2B等产量相关基因对小麦千粒重、粒宽等性状均具有调控作用，可直接影响小麦产量的高低[8-10]。本研究检测结果发现，在供试材料中TaCwi-A1基因高千粒重单倍型TaCwi-A1a的分布频率为42.86%，TaGW2-6A基因高千粒重单倍型Hap-6A-A的分布频率为38.10%，TaSus2-2B基因高千粒重单倍型Hap-H的分布频率为71.43%，这与前人研究结果存在较大差异[19,25]。这可能与云南独特气候地理条件和高产育种中亲本材料选择有关。通过本研究同样发现部分品种的实际千粒重与基因检测结果并不十分吻合，如云麦78、云154-65等品种生产中平均千粒重仅40 g左右，但基因型检测为TaCwi-A1a/Hap-6A-A/Hap-H高粒重单倍型组合。这说明千粒重是由多基因位点控制的，品种实际粒重表现是多种基因以及生长环境田间共同作用的结果，品种产量性状评价需兼顾表型和基因性，同时需继续发掘其他相关基因位点的功能，才能更好地在产量性状遗传改良分子标记辅助育种中应用。