非诺贝特对非酒精性脂肪性肝病小鼠模型肠道菌群多样性的影响

张 丹， 周 波， 邓 溢， 文 玉， 吕俊衍， 王金香， 耿坐涛， 罗粟风， 应昀晏， 文代艳， 施春晶， 普光宇， 姜 鑫， 马岚青

1 昆明医科大学第一附属医院 消化内科， 昆明 650032； 2 昆明医科大学基础医学院， 昆明 650500；3 丽江市儿童医院 普外科， 云南 丽江 530721

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他确定的损伤因素外所导致的临床病理综合征，主要特征为肝细胞内脂肪过度堆积。包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、相关肝硬化和肝细胞癌[1]。NAFLD不仅会影响患者的肝胆系统，还与胰岛素抵抗、血脂紊乱、动脉粥样硬化、脂肪栓塞、血液系统疾病等密切相关[2]。随着生活水平的提高，NAFLD的发病率逐年提高且呈低龄化[3]。据估计，世界范围内NAFLD的发病率为25%[4]，在我国一线城市NAFLD的发病率为15%[5]。面对NAFLD的现状，对NAFLD的预防及治疗的研究显得尤为重要。

非诺贝特是一种纤维酸衍生物，其作为过氧化物酶体增殖物激活受体亚型 α(PPARα)的合成配体，能刺激脂肪分解，被广泛用于治疗高甘油三酯血症、血脂异常、糖尿病等代谢性疾病[6-7]。众多文献[8-10]证实，PPARα与NAFLD关系密切，PPARα激动剂可通过刺激脂肪酸氧化、改善脂蛋白代谢有效改善NAFLD。

一系列研究[11]表明，肠道菌群结构改变及过度生长等都是NAFLD发生的原因，而恢复肠道菌群平衡、降低其通透性可改善NAFLD的进展。近年来，Illumina 高通量测序等前沿技术的应用使得肠道菌群与NAFLD的联系得以更深入的研究。肠道菌群可通过肠肝轴影响NAFLD的发展[12]，肠道菌群还可能改善NAFLD的组织学特征，包括脂肪变性，炎症和纤维化；临床研究[13]也发现NAFLD患者的肠道菌群与正常人相比发生组成变化。肠道菌群失调已成为NAFLD发病的重要原因之一，纠正肠道菌群失调可以预防和减轻NAFLD的发生发展，NAFLD同样也可以影响肠道菌群的数量和质量[14]。

益生菌、益生元及抗生素等可调控肠道菌群[15-16]，同时有研究[17-18]得出，虾青素、康普茶等减轻NAFLD可能是通过影响肠道菌群。这些均提示NAFLD与肠道菌群有着密切的联系，但是目前尚未有关于非诺贝特对NAFLD的治疗作用与肠道菌群关系的研究报道，故本研究旨在探讨非诺贝特治疗NAFLD后小鼠的肠道菌群多样性变化，为非诺贝特治疗NAFLD的机制研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物试剂 非诺贝特(货号：F6020)购自美国Sigma公司；羧甲基纤维素钠(货号：C8621)购自北京索莱宝公司，用0.5%的羧甲基纤维素钠将非诺贝特制为混悬液，浓度为4 g/L；油红O染色试剂盒(货号：G1261)、苏木精伊红染色试剂盒(货号：G1261)均购自索莱宝公司。高脂饲料自制(总热量为25.07 kJ/g，其热比为蛋白质20%、碳水化合物20%、脂肪60%)；普通饲料购自昆明医科大学实验动物中心。

1.1.2 实验动物 6周龄C57BL/6雄性小鼠30只，SPF级，体质量21.50～22.50 g，购自南京生物医药研究院[许可证号: SCXK(苏) 2015-0001]，恒温20℃±2℃及湿度50%±5%条件饲养，人工照明明暗各12 h，自由进食水，并每周监测小鼠体质量变化情况。

1.1.3 仪器与设备 组织包埋机、组织切片机均为日本樱花牌；Leica显微镜。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与NAFLD小鼠模型的制备 普通饲料适应性喂养1周后随机分组，分为正常组(N组)、高脂组(H组)及非诺贝特治疗组(P组)，每组10只。正常组持续给予普通饲料，其他组给予高脂饲料，饲料量为每只小鼠(5±1) g/d，持续喂养10周建立NAFLD小鼠模型。非诺贝特治疗组在高脂干预满10周后，开始给予非诺贝特，剂量为40 mg·kg-1·d-1，持续灌胃给药4周。3组小鼠在满14周后，禁食12 h，收集粪便，异氟烷吸入麻醉后脱颈椎处死并迅速取肝组织进行固定。

1.2.2 肝组织HE染色及油红O染色 用10%中性甲醛溶液固定肝组织，脱水、包埋、4 ℃保存，进行常规HE染色；取新鲜肝组织做冰冻切片，利用油红O染色试剂盒，光镜下观察小鼠肝脏脂肪变性情况。

1.2.3 小鼠肠道生物群落多样性分析 Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行OTU(operational taxonomic units)聚类分析和物种分类学分析。基于OTU聚类分析结果，可以进行多种多样性指数分析，以及对测序深度进行检测；基于分类学信息，可以在各个分类水平上进行群落结构的统计。在上述分析的基础上，可以进行一系列群落结构和系统发育等深入的统计学和可视化分析，以上过程均由美吉生物公司完成。

2 结果

2.1 小鼠体质量变化情况 实验过程中各组小鼠状态均良好，食欲佳，性情温顺，饮水和尿量均无明显差异，活动正常。适应性喂养1周后，小鼠平均体质量为(22±0.15)g；高脂饮食干预4周时，H组、P组小鼠体质量较N组有轻微增加，差异无统计学意义(P>0.05)；干预饮食4周后，H组与P组小鼠体质量均呈上升趋势，且在干预10周时，H组、P组小鼠体质量与N组相比明显增加(P值均<0.05)；P组高脂饮食10周后开始给予非诺贝特连续灌胃4周，体质量较H组呈现明显下降趋势(P值均<0.05)(表1)。

表1 各组小鼠体质量变化情况(g)

注:1) 与N组比较，P<0.05；2) 与H组比较，P<0.05。

2.2 肝组织HE染色及油红O染色结果 HE染色结果显示，N组肝细胞排列整齐，核大而圆，结构清晰，无脂肪空泡出现；H组肝细胞胞浆内广泛分布大量大小不等的脂肪空泡；与H组相比，P组无明显空泡状结构。油红O染色结果显示，N组未见明显脂滴，H组可见大量橘红色的脂滴，而P组与H组相比脂滴明显减少，且与N组相似(图1)。

注：H组中HE染色结果显示脂肪空泡(如黑色箭头所示)，油红O染色结果显示橘红色脂滴(如黑色箭头所示)。

2.3 小鼠肠道微生态多样性改变

2.3.1 粪便样本微生物测序OTU分类结果 在97%相似水平下的OTU进行生物信息统计分析，经Miseq测序后，3组12个样本总共获得278 328条优化序列、3089个OTUs，平均每个样本23 194条序列、257个OTUs，其中N组4个样本，共92 776条序列、1169个OTUs；H组4个样本，共92 776条序列、968个OTUs；P组4个样本，共92 776条序列、952个OTUs(表2)。

2.3.2 各组小鼠菌群多样性情况 Shannon-Wiener是反映样本中微生物多样性的指数，其数值的高低可以表示菌群数量的变化，Shannon值越大，说明群落多样性越高。H组与N组相比，H组菌群Shannon指数平均值明显降低，其菌群数量明显减少；P组Shannon指数平均值较N组降低，其菌群丰度减少，但是P组Shannon指数平均值较H组略增加，其菌群丰度相对增高(图2)。

图2 小鼠细菌的Shannon稀疏性曲线

表2 各组小鼠粪便样品测序结果及多样性指数

2.3.3 各组小鼠菌群结构组成 在门分类学水平(图3)，3组样本中拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)差异最为明显。厚壁菌门在H组中占比最高，拟杆菌门在N组中占比最高。3组样本中菌群占比较小的是放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、变形菌门(Proteobacteria)，其中放线菌门在H组中占比较高，仅次于厚壁菌门；疣微菌门在H组中占比较N组显著降低；变形菌门在H组中占比较N组显著增加。

在属分类学水平(图4)，各组菌群的结构组成和菌属占比存在明显的差异，在N组中，Muribaculaceae_norank、毛螺菌科NK4A136组(Lachnospiraceae_NK4A136_group)在肠道菌群中占比最高。与N组相比，H组新增菌属Dubosiella，同时瘤胃球菌属(Ruminococcus_1)消失，其优势菌属的比例也发生变化：在N组为优势菌群的Muribaculaceae_norank、毛螺菌科NK4A136组的占比均明显降低，以Muribaculaceae_norank最为明显；梭菌属(Clostridium)、Turicibacter、双歧杆菌属(Bifidobacterium)成为H组中的优势菌群。与H组相比，P组样本菌群结构基本不变，而优势菌属的比例有所变化：梭菌属、Turicibacter、双歧杆菌属占比降低；Faecalibaculum占比增加，丰度仅次于梭菌属，Muribaculaceae_norank、阿克曼菌属(Akkermansia)、螺杆菌属(Helicobacter)、Lachnospiraceae_unclassified占比也有增加。

图3 门分类水平的分类学组成分析

图4 属分类水平的分类学组成分析

2.3.4 各组菌群整体结构变化 PCA分析，即主成分分析，样本组成越相似，反映在PCA图中的距离越近。H组与N组相比，样本的距离明显增加，样本组成差异性增加；P组与H组相比，样本的距离缩短，样本组成差异性降低(图5)。

图5 小鼠肠道菌群 PCA 分析

2.3.5 各组菌群差异 为了确定各组小鼠中具有显著差异的物种，在组间进行LEfSe分析，结果见图6。在属分类水平上，其中Parabacteroides、Muribaculaceae_g_norank、瘤胃球菌属、毛螺菌属(Lachnospira)等在N组富集；双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属、Turicibacter等在H组富集；拟杆菌属(Bacteroides)、Faecalibaculum、优杆菌属(Eubacterium)等在P组富集。根据LDA值大小(LDA>4)，在N组中拟杆菌门、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、霍尔德曼氏菌属(Holdemania)等占优势，H组中厚壁菌门、梭菌属、放线菌门、双歧杆菌科、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、红蝽菌目(Coriobacteriales)等占优势，P组中拟杆菌门、丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、Acetatifactor、Ruminiclostridium_1等占优势。

3 讨论

在本研究中，通过对小鼠体质量监测、肝组织病理学观察再次验证非诺贝特对NAFLD具有明显的改善作用，在此基础上对小鼠粪便进行高通量测序16S rRNA分析菌群的多样性及差异发现：非诺贝特可能通过增加如拟杆菌门等菌群的丰度，同时降低如厚壁菌门等菌群的丰度，来达到治疗NAFLD的目的。

图6 LEfSe 多级物种层级树图

非诺贝特治疗NAFLD的机制尚不清楚，目前的研究发现非诺贝特主要通过以下途径对NAFLD起保护作用：(1)通过下调AKT/FSAN通路和降低活性氧自由基累积达到降低脂质累积改善NAFLD的目的[19]；(2)通过IRE1α-XBP1-JNK途径减轻肝内质网应激改善NAFLD[20];(3)激活PPARα调控肝脏脂质代谢[21];(4)增强脂肪三酰甘油酶活性，增加甘油三酯水解活性，起到治疗NAFLD的作用[22]。近年来，越来越多的研究[23-24]表明，肠道微生态在NAFLD的发展中起着重要的作用。Lu等[25]和Liu等[26]的研究均表明，以厚壁菌门为代表的有害细菌的数量减少，以拟杆菌属为代表的有益细菌的数量增加可改善NAFLD；Lu等[12]研究提出，有效的调控肠道菌群， 如乳酸杆菌相对丰度增加、厚壁菌门某些属相对丰度减少、厚壁菌门/拟杆菌门比值降低与肝脂质累积降低可能存在一定的联系。同样临床上有研究[13]对NAFLD患者的粪便微生物菌群特征进行了检测，发现NAFLD中厚壁菌门相对丰度较高。在本研究中，非诺贝特治疗的NAFLD小鼠肠道中拟杆菌门丰度增加，厚壁菌门丰度降低，这与以上研究相一致。

本研究中，利用非诺贝特治疗NAFLD的同时，观察了小鼠肠道微生态的多样性变化，尽管目前还不清楚在非诺贝特治疗NAFLD的过程中，肠道微生态扮演着怎样的角色，但这为非诺贝特改善NAFLD的机制研究提供了新思路。究竟是非诺贝特改善了肠道菌群进而改善了NAFLD，还是非诺贝特改善了NAFLD从而恢复了肠道微生态，亦或是非诺贝特协同肠道菌群对NAFLD产生了治疗作用，值得进一步研究。