高通量测序在重症肺部感染患者中的应用效果

任迪 李颖 曾晶晶

[摘要] 目的 探讨高通量测序技术在重症肺部感染患者中的应用效果。 方法 回顾性分析2018年1～12月广东省深圳市第二人民医院重症医学科收治的87例重症肺部感染患者的临床资料。采用数字随机表法分为应用高通量测序患者下一代测序技术（NGS）组43例，对照组44例。比较NGS组病原体检出率，两组患者抗生素使用强度，重症监护病房（ICU）住院天数及28 d病死率。 结果 两组患者治疗前基线资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。NGS组中高通量肺泡灌洗液标本中病原体检出率明显高于常规培养，NGS组抗生素使用强度低于对照组，ICU住院时间短于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。两组患者28 d病死率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 高通量测序技术的应用能提高重症肺部感染患者肺泡灌洗液病原体的检出率，降低抗生素使用强度及缩短住院时间。

[关键词] 高通量测序;重症肺部感染;抗生素使用强度;宏基因组学;下一代测序技术

[中图分类号] R563          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）03（a）-0094-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of high-throughput sequencing technology in patients with severe pulmonary infection. Methods A retrospective analysis of the clinical data of 87 patients with severe pulmonary infection were admitted to the Department of Critical Medicine， Shenzhen Second People′s Hospital from January to December 2018. Random table method was used to divide 43 cases of next generation sequencing （NGS） group and 44 cases of control group. The pathogen detection rate in the NGS group， the intensity of antibiotic use， the number of days in the intensive care unit （ICU）， and the 28-day mortality of two groups were compared. Results There was no significant difference in baseline data of patients between the two groups before treatment （P > 0.05）. The detection rate of high-throughput pathogens in the NGS group was significantly higher than that of conventional culture， the intensity of antibiotic use in the NGS group was lower than that in the control group， and the ICU hospital stay was shorter than that in the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference in the 28 days mortality between the two groups （P > 0.05）. Conclusion The application of high-throughput sequencing technology can improve the detection rate of alveolar lavage fluid pathogens in patients with severe pulmonary infection， reduce the intensity of antibiotic use and shorten the length of hospitalization.

[Key words] High-throughput sequencing; Severe pulmonary infection; Antibiotics use density; Metagenomics; Next generation sequencing technology

重癥肺部感染患者是感染性疾病的主要组成部分，病情复杂、病死率高[1]，需要及时有效地抗感染治疗。在无病原学前提下，临床医生根据经验选用抗生素，同时送标本做微生物涂片及培养，待结果回报后决定是否调整抗生素。因常规微生物培养阳性率低且容易受多种不确定因素影响，这将可能导致抗生素多用、滥用，及时找出致病微生物是感染性疾病治疗的关键。高通量测序技术又称下一代测序技术（NGS）是新型病原检测手段，有快速、精准、阳性率高等特点，非常适合病原体诊断[2]。本研究回顾性分析NGS的重症肺部感染患者病原体检出率、抗生素使用强度及住院时间，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2018年1～12月广东省深圳市第二人民医院重症医学科收治的符合入选排除标准的87例重症肺部感染患者的临床资料。本研究经医院医学伦理委员会批准。纳入标准：①年龄>18岁;②符合《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南》[3]2016版本中的重症肺部感染诊断;③应用抗生素前已留取了肺泡灌洗液及血样本;④病程中有根据NGS结果进行了抗生素调整记录;⑤患者或其家属已签署知情同意书。排除标准：①妊娠期妇女;②急性生理与慢性健康评分（APACHE Ⅱ）>35分或<15分;③合并肺外感染;④送检样本的微生物核酸含量<100 copies/mL。根据随机数字表法分为两组，应用高通量测序患者NGS组43例及对照组44例，两组患者年龄、APACHE Ⅱ评分、简化临床肺部感染评分（CPIS）[4]比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。见表1。

1.2 方法

两组患者均给予经验性抗感染、必要的呼吸机辅助通气、早期肠内营养、维持内环境稳定及脏器功能支持等综合治疗，应用抗生素前收集患者外周血样本2份和肺泡灌洗液样本2份，同时送医院微生物培养以及华大基因临床检验中心进行高通量病原体检测（BGISEQ-50平台）。样本量：医院微生物培养需要外周静脉血2套（需氧瓶+厌氧瓶，各2瓶，每瓶10 mL）及肺泡灌洗液样本至少10 mL，均及时送检;高通量测序样本需要外周静脉血至少2 mL，DNA试管常温暂存，肺泡灌洗液至少需要采集5 mL，4～20℃暂存，2 h内送检，如不能及时送检，血样本常温保存，肺泡灌洗液-20℃保存，24 h内均能送检。

1.2.1 高通量检测阳性判定方法

参照日本名古屋大学医学院研究判定的方法，细菌的判定要求Reads>200，同时P1（占所有微生物的比例）>0.5[5]。

1.2.2 高通量检测微生物致病与定植的判定方法

结合临床，如患者有发热、炎性指标升高、痰液性状改变及影像学改变，判为致病菌;如无临床感染征象，判为定植菌。

1.2.3 抗生素调整方案

均需与临床相结合。

1.2.3.1 NGS组  阳性：根据测序出的病原体针对性调整抗生素为单药窄谱;阴性：继续经验性用药。

1.2.3.2 对照组  根据临床培养结果决定是否调整抗生素。

1.2.4 治疗终点临床治愈、出科。

1.3 观察指标两组患者病原体检出率、抗生素使用强度、重症监护病房（ICU）住院天数、28 d病死率。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验;计数资料以例数或百分比表示，比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NGS组两种检测方法病原体检出率比较

肺泡灌洗液标本中，高通量病原体检出率明显高于常规培养，差异有统计学有意义（P < 0.05）;血标本中，高通量与常规培养比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.2 两组患者抗生素使用情况比较

NGS组抗生素使用强度明显低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）;其中碳青霉素类抗生素使用人数及使用强度比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

2.3 两组患者ICU住院天数及28 d病死率比较

NGS组ICU住院天数明显短于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）;两组患者28 d病死率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表4。

3 讨论

高通量测序技术是近十余年发展起来的技术，2014年首次被报道用于诊断中枢神经系统感染钩端螺旋体的病例[6]。该方法可以快速对样本中全部DNA或RNA进行测序[7-8]。该技术也已经被报道用于血流感染[9]、呼吸道[10]、中枢神经[11]脓肿液、局灶组织[12]等不同标本类型的病原体检测。现已逐渐应用于重症患者的病原微生物的检测中，理论上具有高效、准确及检出未知病原体的特点。2019年2月发布的《宏基因组分析和诊断技术在急危重癥感染应用的专家共识》[13]中肯定了高通量测序技术在危重症患者病原微生物检测中的应用价值。针对重症肺部感染病原体进行高通量测序的研究，经检索国内外文献，仅有少量相关研究发表，Li等[14]针对重症感染患者进行高通量检测病原体的研究中提示，血及肺泡灌洗液样本的NGS组病原检出率均明显高于常规培养组。Xie等[15]研究中也提示，应用了NGS的重症肺部感染患者可以早期明确病原菌，细菌阳性率明显高于对照组，28 d和90 d死亡率明显低于对照组。Pan等[16]在免疫功能低下的社区获得性肺部感染13例患者研究提示，NGS在病毒和真菌检测领域具有明显的优势，而在细菌检测方面未显示出优势。刘孝荣等[17]在针对儿童重症肺部感染肺泡灌洗液应用NGS检测病原体的研究中提示，NGS组灵敏度高（86.84%），能检出未知病原体，优于传统的临床检验方法。本研究中NGS组中高通量病原体检出率显著高于常规培养，NGS组阳性的样本中检出的病原菌有肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、溶血葡萄球菌、乳糖奈瑟球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、棒状杆菌、黏液罗氏菌等，还有部分没有免疫功能障碍基础疾病的患者检测出较高序列数的人类疱疹病毒5型（CMV）、人类疱疹病毒4型（EB病毒）。考虑可能与重症患者免疫功能受到影响有关，未检出真菌及原虫，可能与真菌细胞壁较厚，DNA胞外释放量少有关，而常规培养方法仅检出常见微生物。在不明确致病微生物前提下，临床医生往往给予经验性的广谱抗生素治疗。有研究提示[18]，相对于有明确致病菌而进行的针对性窄谱抗生素治疗，并不能显著改善临床症状及预后且并发症明显增高，NGS是实现感染性疾病精准治疗、避免抗生素滥用的关键技术之一[19]。然而，通过NGS结果指导临床抗生素的应用研究较少，本研究根据理论依据，应用NGS指导抗生素的应用，取得了一定的效果。本研究结果显示，NGS组抗生素使用强度明显低于对照组。在患者28 d死亡率评价中，本研究数据差异无统计学意义，与Xie等[15]研究不一致，可能与疾病严重程度、样本量不同等因素有关。

目前针对高通量测序检测病原体的结果判定还尚无统一标准或共识，Somasekar等[20]自定义mNGS的判读标准，细菌、真菌和寄生虫要求每百万映射读取的Reads（rpm）≥阴性对照的10倍，病毒Reads≥20，同时覆盖度>2%。Zinter等[21]将所有微生物以同一标准划分，要求rpm≥10同时自定义的Z评分≥2分。Simner等[22]在脑脊液病原体测序中沿用了以上的标准，同时认为致病原应排在所有微生物的前5名。Grumaz等[23]设计出SIQ评分试图找到更接近感染的Reads数。国内有部分研究[8，24]，判定标准也尚不统一。本研究中仍在一些不足之处，本研究所采用的日本名古屋大学医学院研究的判定方法是否合适仍需要进一步探讨，NGS阳性的病原菌也未进行PCR验证。现阶段我们正在进行重症感染患者常见不同细菌感染的阳性判断标准的序列研究。

综上所述，NGS是一种新型检测致病微生物的方法，本研究中提高病原体的检出率，减少抗生素的使用强度及住院天数，临床应用中仍有较多的不足之处，需要开展更多的相关研究。

[参考文献]

[1]  Lozano R，Naghavi M，Foreman K，et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010：a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010 [J]. Lancet，2012， 380（9859）：2095-2128.

[2]  Tringe SG，Rubin EM. Metagenomics：DNA sequencing of environmental samples [J]. Nature Reviews Genetics，2005， 6（11）：805-814.

[3]  中華医学会呼吸病学分会.中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016年版）[J].中华结核和呼吸杂志，2016， 39（4）：241-242.

[4]  Luna CM，Blanzaco D，Niederman MS，et al. Resolution of ventilator-associated pneumonia：prospective evaluation of the clinical pulmonary infection score as an early clinical predictor of outcome [J]. Crit Care Med，2003，31（3）：676-682.

[5]  Horiba K，Kawada JI，Okuno Y，et al. Comprehensive detection of pathogens in immunocompromised children with bloodstream infections by next-generation sequencing [J]. Sci Rep，2018，8（1）：3784.

[6]  Prasad J，Sazawal S，Dhingra U，et al. Detection of viable Bifidobacterium lactis HN019 （DR10TM） in stools of children during a synbiotic dietary intervention trial [J]. Int Dairy J，2013，30（2）， 64-67.

[7]  Staley JT，Konopka A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats [J]. Annu Rev Microbiol，1985，39：321-346.

[8]  Miao Q，Ma Y，Wang Q，et al. Microbiological diagnostic performance of metagenomic next-generation sequencing when applied to clinical practice [J]. Clin Infect Dis，2018，67（suppl/2）：S231-S240.

[9]  Ye M，Wei W，Yang Z，et al. Rapid diagnosis of propionibacterium acnes infection in patient with hyperpyrexia after hematopoietic stem cell transplantation by nextgeneration sequencing：a case report [J]. BMC Infect Dis，2016， 16：5.

[10]  Wilson MR，Naceache SN，Samayoa E，et al. Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by next-generation sequencing [J]. N Engl J Med，2014，370（25）：2408-2417.

[11]  Ai JW，Zhang HC，Cui P，et al. Dynamic and direct pathogen load surveillance to monitor disease progression and therapeutic efficacy in central nervous system infection using a novel semi-quantitive sequencing platform [J]. J Infect，2018，76（3）：307-310.