UPLC-Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用快速分析瑶药黄红钻的成分＊

韦 玮，张 萌，周江煜，郝二伟，谢安然，陆海兰，王爱玲，梁琼平，侯小涛**，邓家刚**

（1. 广西中药药效研究重点实验室 南宁 530200；2. 农作物废弃物功能成分研究协同创新中心 南宁 530200；3. 广西中医药大学药学院 南宁 530200；4. 金秀瑶医医院，广西金秀545700）

瑶医药是我国传统医药学的重要组成部分，在漫长医疗实践中，瑶医根据药物的性味功效、临床应用特点及形态特征，归纳出104 味效果较佳、流传广泛、较为常用的瑶药，并称为“老班药”（即祖上传下的药物之意），根据功能主治可以分为“五虎”“九牛”“十八钻”以及“七十二风”。“十八钻”类瑶药中含有苯丙素类、萜类、黄酮类、生物碱、有机酸、甾体等多种成分。具有抗癌、镇痛抗炎、抗氧化、抗衰老、抑菌、保肝、镇静抗癫痫等多种作用，传统瑶医认为“钻”类药物药效峻猛，能透利关节、疏通经络，多为活血化瘀、行气、止痛药，对瘀阻、湿滞的的患者具有较好的疗效，为瑶族民间常用的传统“打药”，多用于治疗各种“肿症”[1]。黄红钻（wiang hongh nzunx）别名胆草、铜钗风、青竹藤，是木犀科植物厚叶素馨（Jasminum pentaneurumHand.-Mazz）的茎叶，在瑶族有着悠久的使用历史，主要分布于广东、海南、广西，属于钻类瑶药“十八钻”之一。广西以金秀瑶族自治县为主要分布区，此外还分布于上思、灵山、罗城、防城、巴马、梧州、鹿寨、玉林、上林等地。其味苦、甘、辛，性平；具有止咳化痰、健脾消肿、补肾益肺、祛风通络等功效；瑶族民间用于崩闭闷（风湿痛、类风湿性关节）、播冲（跌打损伤）、卡西闷（胃痛）、荣古瓦卡西闷（产后腹痛）以及流心黑身翁（虚弱浮肿）等[2]。

瑶药在瑶族民间使用广泛，但却缺少系统的现代药学研究。由于历史的原因，瑶族没有形成自己的文字，瑶医药传承仅靠口授心传，面临着失传的风险，急需进行系统的研究并加以保护。近些年来，为了促进瑶医药的发展和保护，《瑶医效方选编》《中国瑶医学》《中国瑶药学》《实用瑶医学》《瑶医常用植物药化学与药理研究》和《中国现代瑶药》等著作相继出版，为瑶药的研究及保护等提供了技术依据。为了提升瑶药材质量，推广瑶药，《广西壮族自治区瑶药药材质量标准（第一卷）》已收载部分“十八钻”类瑶药质量标准。本课题组承担了“广西瑶药材质量标准（第二卷）品种研究项目”《瑶药材黄红钻质量评价与标准研究（部分）》，前期已开展黄红钻的质量标准研究及化学成分[3，4]研究，结果表明，黄红钻中主要有酚酸类及环烯醚萜苷类化合物，包括反式肉桂酸、10-hydroxyoleoside-11-methyl ester、10-hydroxyoleoside dimethyl ester、10- (3-hydroxy-4-methoxybenzoate) -ligustroside、别旁茶苷等，但还未对黄红钻的全成分进行系统分析研究。

本研究采用UPLC-Q-Exactive 四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱技术，利用其具有高分辨率、高灵敏度等特点，结合自动触发多级质谱技术，得到黄红钻化学成分质谱数据，根据分离的对照品和数据库，比对各色谱峰的一级、二级质谱数据，首次对黄红钻主要成分进行了全面准确的快速识别，共鉴定了23个成分，其中包括有机酸类8个、生物碱类3个、木脂素类3个以及环烯醚萜苷类5 个。黄红钻疗效确切，但尚无有关黄红钻药理活性、质量标准等的文献报道，这与其在瑶族地区的广泛应用是不匹配的。

本研究通过对黄红钻成分的全面分析，以及前期进行的黄红钻化学成分的分离鉴定[3，4]，可以为黄红钻质量标准的研究提供定量、定性的指标性成分；同时也为黄红钻药效物质基础、质量控制及临床应用等提供了科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UPLC-Q Exactive 四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪（Thermo Fisher Scientific 公司，美国），离子源采用HESI 源（heated ESI），Thermo Gold C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.9 μm），Xcalibur 3.0 软 件（Thermo Fisher Scientific 公司，美国），十万分之一天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司），超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），粉碎机（天津太斯特仪器有限公司）。

1.2 试剂

乙腈为质谱纯（默克公司，美国），超纯水（Milli-Q SP Regent Water system，美国），乙酸铵为质谱纯（Fisher，美国），甲醇为分析纯（科隆化学品有限公司，成都），甲酸为色谱纯（东京化成工业株式会所，日本），其余试剂为分析纯。

1.3 药材

黄红钻药材采于广西壮族自治区金秀瑶族自治县，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为木犀科厚叶素馨（Jasminum pentaneurumHand.-Mazz）的茎叶。

2 方法

2.1 UPLC检测条件

色谱柱为Thermo Gold C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流动相：乙腈A-0.1%甲酸水（含10 mmol 乙酸铵）B；梯度洗脱：0-2.0 min，5%A；2.0-42.0 min，5%-95%A；42.0-47.0 min，95%A；47.1-50 min，95%-5%A；流速为0.3 mL·min-1；进样量1 μL；柱温35℃。

2.2 MS检测条件

离子源采用HESI源（heated ESI），喷雾电压：3.5 kV(+)、3.2 kV (-)，鞘气体积流量：30 μL·min-1，离子传输管温度：320°C；辅助气体流量：10 μL·min-1；辅助气温度：300°C。扫描方式Full MS/dd-MS2 模式，采用正、负离子同时采集，扫描m/z范围：100-1500，其中一级Full MS 全扫描选择分辨率为70000 FWHM，dd-MS2的二级扫描选择分辨率为17500 FWHM，特定离子扫描模式为“off”，喷雾气为氮气，碰撞气为高纯氮。

2.3 供试品溶液

干燥黄红钻药材粉碎，过65 目筛，精密称取黄红钻药材粉末1 g（精确至0.0001 g），置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇25 ml，称定质量，超声提取30 min，再次称定质量，用70%甲醇补足失重，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

3 结果与分析

取黄红钻供试品溶液及混合对照品储备液，按“2.1”、“2.2”项下色质谱条件进行分析，分别得到正、负离子及质谱图（图1）。使用Xcalibur 3.0软件对高分辨质谱信息进行数据分析，结合相关文献报道、中医药资料库及对照品进行化合物的确认（表1）。

图1 黄红钻UPLC-Q-Exactive MS的TLC图

3.1 有机酸类

有机酸类化合物广泛存在于自然界植物中。本实验从黄红钻中共鉴定出了8 个有机酸类化合物，分别为莽草酸、原儿茶醛、丁香醛、苯甲酸、对羟基肉桂酸、对羟基安息香醛、阿魏酸乙酯以及6-姜酚。酚酸类化合物在负离子模式下一般能够产生丰度较大的准分子离子峰[M-H]-，在二级质谱中一般都会丢失中性分子（如H2O、CO、CO2等）。以莽草酸为例，该化合物分子式为C7H10O5，负离子模式下，得到m/z173.0450[M-H]-的准分子离子峰，响应值较正离子模式好。该化合物的二级离子碎片信息主要有m/z137.0241、111.0449、93.0343，分 别 对 应[M-H-2H2O]-、[M-HH2O-CO2]-、[M-H-2H2O-CO2]-，根据该化合物的精确分子量、二级裂解方式以及文献报道[5]，确定该化合物为莽草酸。

3.2 生物碱类

在ESI+模式下，共鉴定出3 个生物碱类化合物。化合物5保留时间为1.49 min，一级质谱显示该化合物的准分子离子峰为m/z123.0553 [M+H]+，进一步进行二级质谱扫描，碎片离子为m/z106.0290，是由于准分子离子丢失一个NH2后形成，继续丢失一中性分子CO得到碎片离子。化合物6保留时间为3.81 min，准分子离子峰m/z263.1749 [M+H]+，对母离子进行MS/MS 扫描，主要产生2 个碎片离子，分别为m/z245.1643[M+H-H2O]+，150.1279[M+H-H2O-C5H5NO]+，结合文献报道，鉴定该化合物为氧化槐果碱。同理，根据峰19 的准分子离子峰m/z336.1226 [M+H]+，以及二级质谱碎片离子m/z318.0760[M+H-CH3-H-2H]+、292.0963[M+H-CH3-H-CO]+，并结合文献报道[6]，鉴定该化合物为小檗碱。

3.3 木脂素类

表1 UPLC-Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱对黄红钻化学成分的鉴定分析结果

木脂素类化合物为苯丙素氧化聚合而成。黄红钻中鉴定的该类化合物均为苯丙素二聚体并带糖的木脂素类。这些化合物均易脱去葡萄糖或者鼠李糖残基。比如刺五加苷及松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷均丢失葡萄糖基。苷元在正离子模式下容易丢失H2O中性分子。此外，苷元可断开呋喃环从而得到相应的碎片离子。以松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷[7]为例，该化合物的保留时间为11.48 min，正离子模式下该化合物的准分子离子峰为m/z538.2275[M+NH4]+，准分子离子峰直接丢失一个葡萄糖和H2O 中性分子得到m/z341.1372[M+H-Glc-H2O]+，此后分子中的呋喃环开裂并伴随丢失苯环上的一分子甲氧基从而得到m/z175.0754[M+Na-Glc-H2O-C7H7O2-OCH3]+。

图2 莽草酸的质谱主要裂解途径

图3 氧化槐果碱质谱主要裂解途径

图4 松脂醇-β-D-吡喃葡萄糖苷质谱主要裂解途径

3.4 环烯醚萜苷类

本实验鉴定了5个环烯醚萜苷类成分。根据前期结果，黄红钻中的含量较大的主要成分为裂环环烯醚萜苷类，且化合物21 为新的裂环环烯醚萜苷类化合物[3]。除了化合物10 以外，其他化合物均有丢失162的葡萄糖分子，得到苷元离子。对苷元离子进行二级质谱分析，结果表明，这类化合物的苷元大多易失去H2O、CO2、CO、CH3OH 等中性分子。下面以药材中含量较大的化合物7、20、21为例说明其裂解途径。

化合物7 的保留时间为5.31 min，在负离子模式下，一级质谱信息显示，该化合物的准分子离子峰为m/z419.1194[M-H]-，以此为母离子进行二级质谱扫描，碎片离子为m/z375.1263，为丢失1 个中性CO2分子；碎片离子为m/z239.0562，是母离子丢失1个Glc及1 个中性H2O 分子；碎片离子m/z195.0899 是准分子离子峰接连丢失1 分子Glc、1 分子H2O 和1 分子CO2所致。根据裂解规律，并与对照品比对并结合文献[3,8]，鉴定该化合物为10-hydroxyoleoside 11-methyl ester（图5）。

化合物20的保留时间为15.37 min，负离子模式下给出该化合物的准分子离子峰为m/z549.1686[M-H]-，以此为母离子进行二级质谱扫描，得到m/z239.4657的碎片离子，为母离子丢失1 分子的Glc，随后丢失1分子的肉桂酸酰基所致。除此以外，还得到了其他离子碎片m/z221.0453[M-H-Glc-C9H6O-H2O-H2O]-、177.0554[M-H-Glc-C9H6O-H2O-H2O-CO2]-、145.0292[M-H-Glc-C9H6O-H2O-H2O-CO2-CH3OH]-、117.0344[M-H-Glc-C9H6O-H2O-H2O-CO2-CH3OH-CO]-。根据裂解规律，并与对照品比对，结合文献[3,8]，鉴定该化合物为Jasminoside（图6）。

化合物21 为前期从黄红钻中分离鉴定的新的裂环环烯醚萜苷类化合物。与其他环烯醚萜苷类似，该化合物的负离子模式给出准分子离子峰为m/z689.2081[M-H]-，以该母离子进行MS/MS 扫描，首先得到二级碎片离子m/z527.1548[M-H]-，为母离子丢失一分子Glc 所致。二级质谱离子m/z389.0891，为母离子连续丢失一个Glc，一个对羟基苯乙烷分子，一个H2O得到。m/z389.0891 的碎片离子陆续丢失CH2O 及中性分子CO2得到m/z359.1129 及m/z359.1129。m/z291.0877为该化合物经类似于非裂环环烯醚萜苷类化合物母环断裂，生成1,6F-特征碎片离子的模式而产生[8]。根据裂解规律，并与对照品比对，鉴定该化合物为10-(3-hydroxy-4-methoxy-benzoate)-ligustroside（图7）。

图5 化合物10-hydroxyoleoside 11-methyl ester的质谱裂解途径

图6 化合物jasminoside的质谱裂解途径

4 讨论与结论

本研究通过高分辨质谱正、负离子模式检测黄红钻药材中所含成分，根据各成分所形成的色谱峰在质谱中的色谱保留时间、精确相对分子质量、质谱裂解规律和二级质谱离子碎片信息，并结合对照品的质谱信息和参考文献，快速地阐明了黄红钻中的成分并首次鉴定出黄红钻中的23 个化学成分，包括有机酸类8个、生物碱类3 个、木脂素类3 个、环烯醚萜苷类5 个，并对有机酸、生物碱、木脂素、环烯醚萜苷四类成分的裂解途径进行了分析总结。本研究为其后续药效物质基础的研究以及更深入的开发利用提供了依据。

图7 化合物10-(3-hydroxy-4-methoxy-benzoate)-ligustroside的质谱裂解途径