花生品种缺失过敏蛋白的筛选和品种间过敏原性的比较

高美须 王传堂 许舒婷 牟 慧 王梦莉 姜小燕

(1.中国农业科学院农产品加工研究所/农业农村部农产品质量安全收贮运管控重点实验室,北京 100193;2.山东省花生研究所,山东 青岛 266100)

食物过敏是指人体对食物过敏原产生的过敏反应,是食物中的正常营养成分所引起机体免疫系统的异常反应[1]。WHO 报道有超过40%的人曾受到食物过敏的困扰,食物过敏已成为当今世界普遍存在的食品安全问题。流行病学研究显示,约33%的过敏反应由食物诱发,而花生引起的食物过敏占其10%～47%[2]。叶世泰等1986年在我国常用食品致喘40例分析中指出,花生等油料作物位居食物过敏原的前列[3]。

我国是花生生产大国,产量居世界第一位,花生品质优良,在国际市场上享有盛名,其出口贸易占国际花生市场约一半的份额[4]。过敏性疾病在医学上无法根治,过敏患者只有通过避免食用含过敏原的食物才能得以避免过敏。筛选低致敏品种或致敏蛋白缺失的品种作为育种材料,用传统或基因工程方法选育出含较少过敏原的花生品种,对降低花生过敏发病率和丰富过敏患者的食物种类都具有重要的现实意义。

花生中的蛋白是引起食物过敏的主要诱因,花生仁蛋白含量高达24%～36%。国际免疫联合会命名小组委员会认可的花生过敏原有11种:Ara h 1～11,其中Ara h 1～3是国内外公认的主要过敏原。Ara h 1占花生总蛋白量的12%～6%,分子量为63.5 kDa[5],等电点为4.55,可被90%以上的花生过敏患者血清识别[6],热稳定性强,耐酸碱,不易被消化。Ara h 2约占花生蛋白总量的10%左右,等电点为5.2[7],属于2S白蛋白家族,与许多种子储藏蛋白有很大的同源性,同样可被90%以上的花生过敏患者血清所识别。Ara h 2有两个同种异型体:Ara h 2.01和Ara h 2.02,它们的相对分子量分别为17 kDa和20 kDa[8]。Ara h 3属于大豆球蛋白类,可被45%的花生过敏患者血清所识别,文献报道Ara h 3至少有5种同种异型体,相对分子量14～45 kDa[9]。P Rabjohn等[10]用分子生物学手段得到的重组Ara h3,其相对分子量为60 kDa,这也是国际免疫联合会命名小组委员会认可的Ara h 3的相对分子量。花生的其他过敏原组分含量及致敏性都较低,研究也相对较少[11-12]。目前花生过敏蛋白的研究多集中在过敏原的检测和降低过敏蛋白的致敏性方面,如免疫学中的印迹法、酶联免疫吸附实验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)等,以及生物传感器、质谱法等检测方法[13],胡纯秋研究了用于过敏患者免疫治疗的重组Ara h 2低致敏蛋白[14]。在品种的致敏蛋白缺失方面,关荣霞等分析了我国栽培大豆品种的过敏蛋白缺失情况[15],美国农业部报道了一种不含Ara h 2过敏原的花生品种[16],尚未见我国栽培花生品种中有关过敏蛋白的报道。

我国是世界上保存花生种质最多的国家,本试验选取中国5个不同品种类型4个省份的33个主栽花生品种,和日本的23个栽培品种为研究对象,利用我国对花生过敏的病人血清分析花生主要原Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3的缺失情况,并进一步分析花生品种间致敏性差异,筛选出致敏蛋白缺失或低致敏性的品种,为花生过敏患者过敏提供低致敏花生食品以及低致敏花生育种提供支持。

表1 中国花生品种名称与来源Table 1 Names and origin of Chinese peanut varieties

1 材料与方法

1.1 供试材料

33种中国花生的名称、类型和栽培省份见表1。23种日本花生编号依次为JP-1～JP-23。所用品种由山东省花生研究所提供,2011年5月在青岛种植,10月收获。北京协和医院变态反应科提供的8例花生过敏患者血清制备血清池,备用。预染的蛋白Maker(14.4～97.4 kDa,英国BiolabsInc公司);十二烷基磺酸钠(SDS)、丙烯酰胺(Acr)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)等试剂购于美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

AE-8130型电泳仪和AE-6450型垂直电泳槽(日本ATTO 公司);DYY-6C 型电泳仪、DYCZ-24D 型垂直电泳槽、DYCZ-40D 转印芯和WD-9405B型水平摇床(均来自北京六一仪器厂);AlphaEase®FC凝胶成像系统、5cm 宽透析袋和硝酸纤维素膜(购自美国Sigma公司);TGL-16M 型高速台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);JY92-ⅡN超声波粉碎细胞机(宁波新芝生物技术股份有限公司);HH-4数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);电热鼓风干燥箱(上海—恒科学仪器有限公司);GS-04A粉碎机(北京锟捷玉诚机械设备有限公司);Genesis25XL冷冻干燥机(美国Virtis公司);QL-901涡旋混匀器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.3 方 法

1.3.1 花生过敏原的提取

将精选的花生仁于电热鼓风干燥箱内37.5℃,干燥1 h左右至红衣易脱去,随后少量多次用粉碎机粉碎。粉碎样品采用直接浸提法,即每克花生粉加入7 mL正己烷过夜低温振荡脱脂,10000 r/min 4℃离心10 min后倾去上清液正己烷,沉淀于通风橱室温风干,过60目筛得脱脂花生粉,密闭低温保存。脱脂花生粉按1:20(m/v)加入10 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4,0.15 mol/L NaCl),在0℃超声波破碎细胞壁处理,选择参数为200 W,超声5 s,间隔2 s,超声60次。超声后的脱脂花生粉溶于磷酸盐缓冲液中,12000 r/min 4℃离心15 min,其上清液即为花生过敏蛋白液。将得到的花生过敏蛋白液4℃透析48 h,期间间歇性地搅拌透析液。透析过的过敏蛋白液经冷冻干燥后得到过敏蛋白粉,冷冻储存备用[17-18]。

1.3.2 过敏原的SDS-PAGE电泳分析

参照Laemmli的方法[19],用不连续凝胶垂直板电泳来测定花生过敏蛋白的蛋白质分子量,用美国AlphaEase®FC凝胶成像系统进一步分析出各主要花生过敏蛋白的相对含量。

蛋白相对含量/%=(单条泳道单个灰度值/单条泳道总条带灰度值)×100

1.3.3 免疫印迹鉴定

免疫印迹实验,将样品经过不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),电转移条带至硝酸纤维素膜上,封闭后,进一步用一抗二抗孵育,孵育完洗膜,显色处理来鉴定花生过敏蛋白存在的情况。

1.3.4 花生蛋白过敏原性测定

采用间接ELISA 方法[7],确定抗原包被浓度为1μg/mL,抗原稀释度为1:500,封闭后,进一步用一抗二抗孵育,孵育后加TMB显色15 min左右,加ELISA终止液终止反应,在酶联免疫检测仪上测定酶标板各孔450 nm 下的光密度OD值。

2 结果与分析

2.1 56个花生品种的过敏蛋白种类比较

花生中主要过敏原有8种,即Ara h 1(63.5 kDa)、Ara h 2(20、17 kDa)和Ara h 3(39、35、30、24和14 kDa)。33种中国花生品种的SDS-PAGE电泳结果如图1,Marker的分子量介于7 kDa至175 kDa。从电泳图谱可看出,所有中国花生品种均含有分子量为63.5 kDa的Ara h 1。Ara h 2有分子量为20 kDa和17 kDa的两个同种异型蛋白,中国花生品种中没有发现缺失这两种蛋白的花生品种。对有4种不同蛋白的Ara h 3,没有在这33种花生品种中发现缺失Ara h 3(39,30,14 kDa)的品种,但在普通型的花生品种中发现了有过敏蛋白条带Ara h 3(35 kDa)缺失的品种14号绥中大花生和17号沭阳大站秧,过敏蛋白条带Ara h 3(24 kDa)缺失的品种11号新金伏大、12号兴城大花生和16号如东碗儿青。除了普通型发现缺失过敏蛋白条带外,编号19～25的多粒型花生、编号26和27的龙生型花生、以及编号28和29的中间型花生中,均未发现8种主要过敏蛋白条带缺失的品种。

从电泳图谱上看,日本花生品种与中国花生品种间差异不是很显著,品种间主要过敏蛋白条带分布相似。与中国花生品种一样,Ara h 1(63.5 kDa)的条带颜色最深,宽度最宽,含量最高,所有日本花生品种中没有缺失该蛋白的品种。也没出现缺失Ara h 2(20,17 kDa)的品种。只有JP-16与JP-19的Ara h 3(24 kDa)有缺失,其他品种没有发现过敏蛋白Ara h 3条带的缺失。

图1 中国不同品种花生过敏原的SDS-PAGE凝胶电泳图谱Fig.1 SDS-PAGE map of Chinese peanut allergen

图2 日本不同品种花生过敏原的SDS-PAGE凝胶电泳图谱Fig.2 SDS-PAGE map of Japanese peanut allergen

2.2 56个花生品种的过敏蛋白含量比较

从电泳图谱中可看出花生品种中主要致敏蛋白的条带是否有缺失,但对过敏原的含量并不清楚,无法客观地分析花生品种间的致敏性差异。因此需要采用美国AlphaEase®FC凝胶成像系统分析各主要花生过敏蛋白的相对含量,进一步科学地分析花生品种间的过敏原含量的差异。

从表2可得出,Ara h 1(63.5 kDa)相对含量最高,其在中国花生品种中的含量分布为25.0%～47.6%。花生品种的类型不同,其Ara h 1的相对含量也不一样,总的来说,各类型Ara h 1的相对含量的顺序为中间型＞龙生型＞普通型＞多粒型＞珍珠豆型。从地域分布上来看,山东＞辽宁＞江苏＞福建。含量最高的是编号为25的即墨小红墩,含量达到了47.6%。含量最低的是编号为6的花育20号,含量为25.0%。其中珍珠豆型的2号和7号品种的Ara h 1含量明显低于其他品种。对于

过敏原Ara h 2 (20 kDa),其相对含量在4.9%～14.0%之间。所研究的中国花生品种中约70.0%的花生品种含量都大于7.0%。总体上Ara h 2(17 kDa)相对含量比Ara h 2(20 kDa)低,在0.2%～11.7%之间。其中11号新金伏大、16号如东碗儿青、26号长清一丛生、29号鲁花10号Ara h 2(17 kDa)的相对含量低,均在1.0%以下。

Ara h 3(39 kDa)的相对含量在3.0%～9.5%之间。Ara h 3(35 kDa)的相对含量最高为8.1%。Ara h 3(30 kDa)的相对含量在1.8%～10.0%之间,其中约42%的品种其含量低于5.0%。Ara h 3(24 kDa)的相对含量较低,在0%～6.0%之间。Ara h 3(14 kDa)相对含量较高,在0.9%～16.7%之间。比较而言,珍珠豆型和普通型花生的致敏蛋白含量要高于多粒型。

表2 中国花生主要过敏原相对含量Table 2 The relative content of major allergens in Chinese peanut/%

日本花生品种中Ara h 1(63.5 kDa)的相对含量同样是在所有过敏蛋白中含量最高的,其含量分布为20.2%～39.6%,低于中国的花生品种。国内外的研究均表明Ara h 1的含量在所有的过敏原中是最高的,与本研究结果相一致。Ara h 2(20 kDa)的相对含量在5.6%～12.2%之间,Ara h 3(39 kDa)、Ara h 3(35 kDa)的相对含量均在3.4%～10.0%之间,Ara h 3(30 kDa)的相对含量在3.1%～8.6%之间,与中国花生相似,Ara h 2(17 kDa)在日本花生品种中的含量高于中国的,含量在1.2%～11.2%之间。Ara h 3(24 kDa)的相对含量最高为6.5%,JP-16、JP-19缺失此过敏蛋白条带。Ara h 3(14 kDa)的相对含量较高,在3.2%～15.9%之间。

表3 日本花生主要过敏原相对含量Table 3 The relative content of major allergens in Japanese peanut/%

图3 中国花生过敏原的电泳/免疫印迹图谱Fig.3 SDS-PAGE/Western blotting of Chinese peanut allergens

图4 日本花生过敏原的电泳/免疫印迹图谱Fig.4 SDS-PAGE/Western blotting of Japanese peanut allergens

2.3 花生品种过敏蛋白的过敏原性比较

过敏原的过敏原性的鉴定需免疫印迹图来确定。为有效利用患者血清,我们仅选取代表性的花生品种进行试验,免疫印迹如图3、图4所示。可以观察到,主要过敏蛋白Ara h 1(63.5 kDa)、Ara h 3(30、24 kDa)在免疫印迹图中可清晰地识别,这3种蛋白很可能是引起中国花生过敏病人的主要蛋白,而其他5种过敏蛋白条带只能模糊观察到。日本花生品种的免疫印迹图基本和中国品种的相同,都是Ara h 1(63.5 kDa)、Ara h 3(30、24 kDa)这3条条带与花生过敏患者的血清产生了反应。

表5 日本花生品种间接ELISA 免疫原性 (OD 值)Table 5 Optical density of ELISA of Japanese peanut

2.4 56个花生品种蛋白的过敏原性比较

从电泳图谱和免疫印迹图谱中得出不同花生品种间,过敏原的种类和相对蛋白含量均有差异,但是对于过敏原总体上免疫活性的高低还需要间接ELISA的方法从量上进行分析。下表中所得数据均是ELISA试验结果,其OD值越高,过敏原性越强。从表4中发现,所测得的中国花生品种的OD值在0.402～0.889之间,最低的是20号铁岭四粒红,最高的是19号营口四粒红。不同品种类型没有明显差异。从表5中发现,日本花生品种的OD值在0.315～0.477之间,JP-10的致敏性最强,JP-6的致敏性最低。JP-16和JP-19均有过敏原条带的缺失,但是其OD值并不是最小的。

3 讨论

3.1 花生品种中发现缺失蛋白的品种

本实验从56个中国和日本花生品种中发现7个有致敏蛋白缺失,证实了花生品种中某种致敏蛋白缺失情况的存在。美国的报道是从300多个花生品种中找到1 个过敏蛋白Ara h 2 缺失的品种[16],我们的研究没有发现Ara h 2缺失,却发现了Ara h 3(24、35kDa)两个致敏蛋白缺失的品种,也说明了不同地区花生品种致敏蛋白缺失的条带可能不同。本研究品种的采集包括珍珠豆型、普通型、多粒型、龙生型和中间型,在所有类型的中国花生品种中,只有来自辽宁和江苏的普通型品种存在过敏原的缺失,即14号绥中大花生和17号沭阳大站秧缺失过敏原Ara h 3(35 kDa),11号新金伏大、12号兴城大花生、16号如东碗儿青缺失Ara h 3(24 kDa)。下一步需要研究这些致敏蛋白缺失品种间是否有亲缘关系,并进行进一步的分子水平验证,为低致敏花生育种提供科学的材料。

3.2 花生中过敏蛋白种类含量和过敏原性的关系

本研究发现缺失Ara h 3的花生品种14号绥中大花生、17号沭阳大站秧、11号新金伏大、12号兴城大花生和16号如东碗儿青的过敏原性并不比其他品种低,17号品种的过敏原性还处于较高的水平(OD 值0.799),这可能和所用的病人血清对缺失蛋白不够敏感,或对其他过敏蛋白更敏感有关。在过敏原蛋白条带分析与相对含量分析过程中,对于缺失或个别过敏蛋白含量很低的品种,测得的过敏原性OD 值都不是最低的,由此可见,花生的致敏性并不单一地被条带的缺失或含量高低所限制,因此花生品种的过敏性与其过敏蛋白种类或含量之间并不存在线性关系。因此找到了缺失一种过敏蛋白的花生品种,只是为解决问题提供了一种可能性。过敏反应是人体的复杂病理过程,作物品种和人类个体差异均是造成过敏反应不同的因素,本研究中日本花生品种的过敏原性相对于中国的品种弱一些,可能与花生过敏患者血清来自中国过敏患者有关。

4 结论

56个花生品种中过敏蛋白Ara h 1的含量最高,Ara h 2、Ara h 3的含量次之。在中国普通型花生品种的14号绥中大花生和17号沭阳大站秧中发现缺失过敏蛋白Ara h 3(35 kDa),11号新金伏大、12号兴城大花生、16号如东碗儿青、日本花生品种JP-16和JP-19缺失过敏蛋白Ara h 3(24 kDa)。决定花生的致敏性因素复杂,单纯过敏蛋白条带的缺失或含量高低与花生致敏性没有线性关系。