7个灌木柳无性系铅富集能力比较

黄瑞芳，王红玲，施士争

(1.江苏省林业科学研究院， 江苏 南京 211153； 2.江苏省农业种质资源保护与利用平台， 江苏 南京 210014)

随着工农业的发展，重金属污染对生态环境的危害越来越严重。铅不能被生物代谢所分解，在环境中滞留的时间较长，且能通过食物链在动物和人体内富集，对人体的肾脏、血液、神经系统等危害极大[1-2]。目前，中国珠江三角洲平原典型区地下水和长江三角洲典型地区土壤都受到较严重的铅污染[3-4]。植物修复技术是近10 a发展起来的利用植物清除土壤污染物的原位修复技术，是治理重金属污染土壤的重要途径之一，具有投资较小、维护成本低、操作简便、不造成2次污染等优点[5]。Pb沉积在土壤中，积累到一定程度就会对植物产生毒害[6]，因此一些生物量大、对污染物吸收能力强的耐性植物，越来越多的受到相关学者的关注和研究。

我国柳树资源丰富，有257种、122个变种、33个变型，在河岸、湖滨绿化中大量使用，广泛分布在我国各个地区。柳树，尤其是灌木柳，其根系发达，适应性强，耐水湿，生长速度快，生物量大，且不直接与食物链相联系，与草本植物相比，因其高积累性，修复能力高[7]，有研究甚至认为柳树是重金属的超积累植物[8-9]。因此柳树是植物修复的理想材料[10]，适合用于修复低、中浓度重金属污染[7,10-11]。柳树资源丰富，且其种及无性系间修复能力差异大，因此挖掘、开发与利用我国丰富的柳树种质资源用于植物修复，前景广阔。笔者所在课题组前期已进行了柳树修复铅污染的部分研究，研究较多的是柳树在铅胁迫下的生长表现，而对柳树体内铅含量的测定和柳树铅富集能力的比较研究较少。本文开展重金属 Pb 胁迫对7个灌木柳树的生长形态、生物量、耐性指数、铅含量以及转运系数的影响研究，旨在了解铅对灌木柳生长的影响及灌木柳对Pb的耐性特征，为进一步研究柳树对铅的累积机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

7个灌木柳(见表1)试验材料隶属杞柳(Salixintegra)、簸箕柳(S.suchowensis)和蒿柳(S.viminalis)。所有参试材料均来自于江苏省林业科学研究院国家柳树良种基地柳树种质资源圃。

表1 供试无性系

1.2 试验方法

于2019年3月选取长15 cm、直径1 cm的健壮插穗，于清水中培养，2周后，挑选生长势一致的柳树苗，置于200 mL培养瓶中培养，每瓶3株，每株插穗没水深度约10 cm。通过改良Hogland营养液培养2周后进行铅处理，4周之后收获植株。铅处理具体设计为：以Pb(NO3)2的形式加入Pb2+，处理组质量浓度分别为0 (CK), 20 (处理1), 40 mg/L(处理2)和80 mg/L(处理3)。试验设置重复4次，过程中每周换营养液1次。为避免铅产生沉淀，开始铅胁迫后，营养液中不再加入KH2PO4。

1.3 测定方法

试验分根、茎、叶收集测定材料。先用自来水冲洗植株，然后用去离子水反复冲洗干净，并用吸水纸擦干，根部用EDTA洗去表面附着的铅，于105 ℃杀青30 min后，烘干至恒重，分别称取其生物量(即干物质量，DW)。按照《食品安全国家标准 食品中铅的测定》(GB5009.12-2017)中的方法进行植物地上部和地下部铅含量的测定。并计算其耐性指数(Tolerance index，TI)[12]，计算公式为TI=DW(胁迫)/DW(CK)；生物转运系数(Translocation factor，TF)=地上部分的铅总量/地下部分的铅总量；以及表性阈值，通常将植物生物量下降50%时介质的重金属含量称之为毒性阈值(EC50)。得到的数据利用Excel 2010和IBM SPSS Statistics 19分析。

2 结果与分析

2.1 铅胁迫对柳树无性系生长和生物量的影响

植物的生物量受生长环境影响，是耐铅性的重要评价因子之一[13]。生物量越大，植物体的盖度越大，吸收的重金属量也越多，修复受污染土壤的效果越好[14]。随着铅胁迫质量浓度的增大，供试无性系生长整体上呈现下降趋势：处理1出现黄叶状况，处理2出现枯叶、部分死亡状况，处理3出现枯叶掉落、死亡增多的状况。经Pb2+处理4周后，无性系存活率的结果(见表2)显示：P681，P1024，P126在各胁迫质量浓度下存活率均为100%，其他无性系的存活率在各质量浓度铅胁迫下均出现不同程度的降低。

方差分析表明，各无性系和各处理间生物量差异极显著(Sig. < 0.01)(见图1)。生物量(g)及多重比较结果表明：CK(a)(5.68±0.89)>处理1(b)(3.31±0.67)>处理2(c)(2.55±0.51)>处理3(c)(2.33±0.44)；P681(a)(4.04±1.80)>P336(ab)(3.85±1.34)>P1024(ab)(3.52±1.09)>P61(ab)(3.47±1.78)>P646(ab)(3.28±1.88)>P683(ab)(3.14±1.32)>P63(b)(2.98±0.83)。

表2 不同供试柳树无性系的存活率 %

图1 不同质量浓度铅胁迫下各柳树无性系的生物量

方差分析显示，P63在3个处理下生物量均无显著差异；P1024，P646，P61，P681，P683在处理2与处理3之间无显著差异，而P336的3个处理之间差异显著或极显著。

在无铅胁迫时(CK)，各无性系生物量范围为4.33—6.86 g，平均值为5.68 g。其中，P63的生物量显著低于其他无性系，而P681显著高于除P61外的其他无性系；铅胁迫质量浓度为20 mg/L时，各无性系生物量范围为2.37-4.06 g，平均值为3.31 g。其中，P63显著低于除P61外的其他无性系，而P336生物量最高；铅胁迫质量浓度为40 mg/L时，各无性系生物量范围为1.90—3.42 g，平均值为2.55 g。其中，P683显著低于除P646之外的其他无性系，P336显著高于其他无性系；铅胁迫质量浓度为80 mg/L时，各无性系生物量范围为1.61—2.83 g，平均值为2.33 g。其中，P646显著低于其他无性系，而P1024，P681，P63显著高于其他无性系。

2.2 铅胁迫对供试柳树无性系铅污染耐性指数的影响

总体而言，随着铅质量浓度的升高，各柳树无性系的耐性指数总体表现为逐步降低的趋势(见图2)。耐性指数(%)及多重比较显示，处理1(a)(58.94±2.31)>处理2(b)(45.87±11.36)>处理3(b)(42.32±12.13)；P63(a)(58.79±1.95)>P1024(a)(57.23±3.00)>P336(a)(56.61±4.37)>P683(ab)(50.21±4.70)>P681(bc)(45.07±2.87)>P61(c)(39.01±1.31)>P646(c)(36.39±3.21)。

P336，P646各处理耐性指数之间的差异显著，P63各处理之间无显著差异，P61处理1与处理2之间无显著差异，P1024，P681，P683处理2与处理3之间无显著差异。

铅胁迫质量浓度为20 mg/L时，各柳树无性系的耐性指数范围为43.17%—71.14%，平均值为58.94%。P1024，P336，P683显著高于其他无性系，而P61显著低于除P646外的其他无性系；铅胁迫质量浓度为40 mg/L时，各柳树无性系的耐性指数范围为34.74%—61.22%，平均值为45.87%。其中，无性系P336和P63显著高于其他无性系；铅胁迫质量浓度为80 mg/L时，各柳树无性系的耐性指数范围为25.66%—60.25%，平均值为42.32%。其中，P646显著低于其他无性系，而P63，P1024显著高于其他无性系。

图2 不同质量浓度铅胁迫下各柳树无性系的耐性指数

2.3 不同柳树无性系对铅的毒性阈值

使用多项式拟合曲线对柳树的毒性阈值进行模拟，不同柳树无性系对铅的毒性阈值(EC50)见表2。其中，P683的EC50最高，达到215.780 mg/L，而P646的EC50最低，只有22.911 mg/L。

表2 不同柳树无性系的毒性阈值

2.4 铅胁迫对柳树无性系体内铅含量的影响

柳树体内铅含量的多少直接反映了其对铅胁迫的耐受力。总体而言，随着铅质量浓度的升高，各无性系植株体内的铅含量总体上逐步升高(见图3)。无铅胁迫时，各无性系的铅含量均为0(未检测到)。铅含量(mg/kg)及多重比较结果表明：处理3(a)(2 794.82±202.48)>处理2(b)(1 934.09±177.61)>处理1(c)(1 410.32±157.33)；P683(a)(2 862.07±365.95)>P61(a)(2 776.20±56.74)>P681(ab)(2 497.31±424.13)>P336(bc)(1 790.56±297.00)>P1024(c)(1 611.63.96±180.92)>P63(c)(1 500.53±312.53)>P646(c)(1 286.55±24.42)。

P1024，P336，P63各处理之间铅含量差异极显著；P681处理1与2之间无显著差异，处理3极显著增高；P61，P683处理2与处理3之间无显著差异；P646处理之间无显著差异。

图3 不同质量浓度铅胁迫下各柳树无性系的铅含量

铅胁迫质量浓度为20 mg/L时，各柳树无性系植株体内铅含量范围为674.00—2 967.30 mg/kg，平均值为1 410.32 mg/kg。P61显著高于其他无性系，P63显著低于其他无性系；铅胁迫质量浓度为40 mg/L时，各柳树无性系植株体内的铅含量范围为1 106.90—3 485.20 mg/kg，平均值为1 934.09 mg/kg。P63显著低于其他无性系，P683显著高于其他无性系；铅胁迫浓度为80 mg/L时，各柳树无性系植物体内的铅含量范围为1 230.10—4 185.07 mg/kg，平均值为2 794.82 mg/kg。P646显著低于其他无性系，P681，P683显著高于其他无性系。

2.5 铅胁迫对柳树无性系植株体内铅总量的影响

柳树体内吸附铅总量的多少直接反映了柳树修复铅污染的能力。各柳树无性系植株体内的铅总量表现如图4。铅总量(μg)及多重比较表明，处理3(a)(6 579.41±573.98)>处理2(b)(4 756.57±368.26)>处理1(b)(4 697.22±446.35)；P681(a)(7 432.79±980.72)>P61(a)(6 950.69±377.06)>P683(ab)(6 420.28±577.23)>P336(bc)(5 121.27±318.40)>P1024(cd)(4 608.11±433.91)>P63(cd)(3 887.01±811.81)>P646(d)(2 990.64±335.59)。

P1024，P61，P63，P681各处理之间铅总量差异极显著；P336处理1与处理2之间无显著差异，而处理3铅总量显著增加；P646处理1显著高于其他处理；P683处理1与2之间无显著差异，处理2与处理3之间无显著差异。

铅胁迫质量浓度为20 mg/L时，各柳树无性系植株体内铅总量范围为1 696.24—8 100.89 μg，平均值为4 697.22 μg。P61，P681显著高于其他无性系，而P63显著低于其他无性系；铅胁迫浓度为40 mg/L时，各柳树无性系体内铅总量范围为2 919.06—6 915.86 μg，平均值为4 756.57 μg。P61显著高于除P683外的其他无性系；铅胁迫浓度为80 mg/L时，各柳树无性系体内铅总量范围为2 022.48—11 098.45 μg，平均值为6 579.41 μg。P681显著高于其他无性系，P646显著低于其他无性系。

图4 不同质量浓度铅胁迫下各柳树无性系体内的铅总量

2.6 铅胁迫对柳树无性系转运系数的影响

转运系数越大，证明地上部分的铅含量越多，反映了柳树向地上部运输铅的能力强。不同铅胁迫下各柳树无性系的转运系数如图5。转运系数及多重比较表明，处理1(a)(0.007 6±0.001 2)>处理2(ab)(0.005 2±0.001 1)>处理3(b)(0.003 5±0.000 4)；P1024(a)(0.009 8±0.001 7)>P683(ab)(0.007 6±0.002 5)>P681(bc)(0.005 3±0.001 6)>P336(bc)(0.004 7±0.000 5)>P646(bc)(0.004 3±0.000 7)>P61(bc)(0.003 5±0.000 6)>P63(c)(0.003 1±0.000 7)。P1024，P646处理2显著高于其他处理，P336处理1和处理2之间无显著差异，而处理3显著降低；处理2显著低于其他处理；P61，P63各处理之间转运系数差异极显著；P681，P683处理1极显著高于其他处理，处理2与处理3之间无显著差异。

铅胁迫质量浓度为20 mg/L时，各柳树无性系转运系数范围为0.001 9—0.017 4，平均值为0.007 60。P683转运系数显著高于其他无性系，P61转运系数最低；铅胁迫质量浓度为40 mg/L时，各柳树无性系转运系数范围为0.001 8—0.016 1，平均值为0.005 2。P1024转运系数显著高于其他无性系，P646转运系数最低；铅胁迫浓度为80 mg/L时，各柳树转运系数范围为0.000 4—0.005 9，平均值为0.003 5。P63转运系数显著低于其他无性系。

图5 不同质量浓度铅胁迫下各柳树无性系的转运系数

3 结论和讨论

目前关于柳树修复重金属污染的研究越来越多[15-17]，植物修复的效果主要取决于植物体内重金属的含量、生物量和植物生长速率[18]。本研究选择了3种质量浓度的铅胁迫处理，根据各处理灌木柳无性系的表现可以看出：P61在低质量浓度铅胁迫时，铅含量较高，随着铅胁迫质量浓度的增加，体内铅含量不再增加，这可能是因为P61启动某个机制来保护自己不再吸收铅，所以在高质量浓度铅胁迫下，生物量与低质量浓度时生物量相当，而其在低质量浓度铅胁迫下，铅总量显著高于其他无性系，因此P61适合低质量浓度铅污染修复；P63和P1024随着铅胁迫质量浓度的增高，体内铅含量极显著增加，而生物量在高质量浓度铅胁迫下无显著降低，存活率均为100%，耐性指数均在50%以上，因此，较适合高质量浓度铅污染修复；P646随着铅胁迫质量浓度的增加，体内的铅含量并无显著增加，但是生物量却随着铅胁迫的增加而降低，耐性指数在低质量浓度铅胁迫时即降至50%以下(48.80%)，高质量浓度铅胁迫时降低至25.65%，因此P646并不适合进行铅污染修复。

由以上结果可以看出，柳树对铅胁迫的差异主要表现在无性系间，而并非在种间，这与前人的研究相符[19]。以后要加强无性系间铅耐受能力的筛选。柳树地上部积累铅越多，越有利于进行铅污染的修复利用。

由转运系数结果可知，柳树积累的铅大量都集中在植株的地下部分，地上部分铅含量极少，这与之前的报道相符[20]。在后续的研究中，可通过添加不同浓度外源非蛋白巯基的合成底物，如半胱氨酸(Cys)和谷胱甘肽(GSH)等，有效提高柳树向地上部分转运铅的能力，来增加柳树对铅污染的修复[21-23]。转运系数在种间的一致性较高，这证明不同基因型的柳树，其转运重金属的机制可能较为一致，这也为今后了解柳树体内重金属的转运机制提供了依据。