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松乳菇菌种固体培养基筛选初步研究

2020-04-19徐丽丽郑华英解春霞刘云鹏

江苏林业科技 2020年1期
关键词:菌丝体松针氮源

徐丽丽,郑华英,徐 明,解春霞,刘云鹏

(江苏省林业科学研究院, 江苏 南京 211153)

松乳菇[Lactariusdeliciosus(L.) Gray]属红菇科(Russulaceae)乳菇属,又名雁来蕈等,是松林山地的特产[1]。子实体中等偏大,乳汁量少,菌盖半球形,初生时菌盖边缘向下内卷,后平展,菌肉虾仁色,菌褶与菌盖同色,初略发白,后呈橘红色,伤后变绿色[1-2]。肉质细腻,味道鲜美、柔和,具独特风味,深受广大食客的喜爱,市场价格可达200元/kg[3-4]。松乳菇更是珍贵的药用真菌,具较高的医用价值[5-6]。具有极高的营养价值,富含多种人体所需的游离氨基酸、不饱和脂肪酸、粗蛋白、矿物质元素等,其根菌提出的松乳菇多糖,具有抗肿瘤、抗病毒、抑菌、调节机体免疫力等功效[7-9]。

松乳菇在中国广泛分布,以长江南岸的品质、口感最佳。但因其为松、杉、柏等植物根系的外生菌根菌,目前未见成功的人工驯化栽培,因而松乳菇的市场供应全依赖于野生人工采摘,这对松乳菇的野外生长环境破坏极大,致使其产量逐年下降[10]。由于其野外生长受自然因素(降雨量、温度、坡向)影响较大,松乳菇产量波动极大,易造成市场紧缺[11-12]。为保护食用菌资源的多样性,规模化开发利用松乳菇半人工栽培广受关注与研究[13-15]。规模化培养松乳菇菌丝体是其开发利用的先决条件,本文对松乳菇不同株菌进行了筛选,并对菌丝固体培养进行了初步研究,以期为后期其林下栽培与开发提供基础。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

试验菌株来自中国林业科学研究院菌种保藏中心菌种资源库,分别为cfcc 6592(山东济宁)、cfcc 83417(辽宁宽甸)、cfcc 84695(湖北)、cfcc 87505(陕西)、cfcc 6594、cfcc 6593和cfcc 7290。

1.2 菌株选择试验

基础培养基为实验室原有的松乳菇固体培养基,配方[16-17]组成为KH2PO4(0.3 g)、MgSO4(0.5 g)、蔗糖(19.9 g)、硝酸钠(0.82 g)、FeSO4(0.5 g)、琼脂(20 g)、VB1(0.1 g)、蒸馏水(1 000 mL)。将试管斜面培养的7个松乳菇保藏菌株活化培养,将活化后菌株直径为 5 mm的菌丝体,接种到基础培养基中央,置于25 ℃的恒温箱中培养,每种处理设重复5个。接种1 d后,每天观察菌丝形态,使用游标卡尺测量并记录菌落直径,以确定适宜的松乳菇菌株。

1.3 固体培养基配方筛选

碳元素在真菌细胞的干质量中占有一半,碳源在真菌发育过程中至关重要。本试验选取葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖等真菌培养过程中的常用碳源进行其最适碳源的选择[17]。通过相同含碳量换算,分别用蔗糖(19.9 g)、可溶性淀粉(18 g)、麦芽糖(20 g)、葡萄糖(20 g)作为碳源,配制成不同碳源的培养基,其他物质较基础培养基不变。使用筛选出的适宜菌株,取直径 5 mm的菌丝体,接种到供试培养基中央,置于25 ℃的恒温箱中培养,每个菌株各设4个碳源处理,每种处理设重复5个。接种1 d后,每天使用游标卡尺测量菌落直径并记录,计算出菌丝覆盖面达培养皿培养基表面50%、达培养皿培养基表面100%的天数。后续氮源及松针水的试验中接种方法、重复、培养温度、观察方法与此相同。

氮源在真菌生长过程中不可缺少。在完成碳源筛选的基础上,将最适碳源基础培养基中的硝酸钠(0.82 g)分别替用成蛋白胨(1 g)、酒石酸铵(0.89 g)、尿素(0.29 g)、谷氨酸(1.42 g)等氮源[17],配制成不同氮源培养基,以含硝酸钠氮源培养基为对照,筛选出最适氮源。

最终培养基:使用适宜的氮源、碳源替换基础培养基中的碳源、氮源,并使用1 000 mL松针水替代基础培养基中等量的蒸馏水,配制最终培养基,接种菌丝体,以未添加松针水的最适碳源、氮源基础培养基作为对照。

2 结果与分析

2.1 不同松乳菇菌株菌丝体生长的比较

将供试菌株接种到培养基上,置于恒温箱25 ℃下培养。观察结果如表1所示,cfcc 6594,cfcc 84695,cfcc 6592和cfcc 83417菌株的菌丝体生长速度相对较快,在30 d内可以长满平板培养皿培养基表面,剩余其他菌株的菌丝体未能长满培养皿培养基表面。因此,选取这4个菌株进行后续试验。接种观察发现,不同菌株间菌丝生长速度有所不同,且基础培养基培养的菌丝较为稀薄,生长速度较慢,需要对基础培养基配方进行改良,使松乳菇菌种菌丝体可以高效生长。

表1 松乳菇不同菌株菌丝体生长时间比较 d

2.2 不同碳、氮源培养基上松乳菇菌种菌丝体生长的比较

2.2.1 不同碳源对松乳菇菌丝体生长的影响 试验结果如表2所示,不同碳源对松乳菇菌种菌丝生长情况的影响前期小于后期,后期差异更为明显。综合菌丝生长覆盖培养基表面达50%和100%的情况,发现cfcc 6592,cfcc 83417菌株在蔗糖碳源培养基上生长速度最快,cfcc84695菌株在葡萄糖碳源培养基上的生长速度最快。cfcc 6594菌株在麦芽糖碳源培养基上生长速度最慢,在30 d的观察期内,菌丝生长覆盖未达到培养基表面的50%,在蔗糖和可溶性淀粉上的生长速度显著大于葡萄糖,根据试验所得数值大小,以及试剂配制的便利性,选择蔗糖作为适宜碳源进行下一步氮源试验。在上述碳源上各菌株的生长速度大小顺序依次为cfcc 6592> cfcc 84695> cfcc 83417> cfcc 6594,而以菌株cfcc6592菌丝体生长最快,在蔗糖碳源培养基上,平均9.3 d可以长满平板培养皿培养基表面。

表2 不同碳源培养基上菌丝体生长覆盖培养基表面50%(A)、100%(B)所需时间 d

2.2.2 不同氮源对松乳菇菌丝体生长的影响 试验结果如表3所示,综合菌丝生长覆盖至培养基表面50%和100% 这2个指标,cfcc6592菌株菌丝体在以酒石酸铵为氮源的培养基上的生长速度较快,cfcc83417在以蛋白胨为氮源的培养基上的生长速度最快。cfcc6594,cfcc84695菌株在硝酸钠氮源培养基上生长速度显著小于其他4个不同氮源,其他4个氮源上的生长速度无显著差异,但在酒石酸铵上标准误较小,稳定性高于另3个氮源,因此选择酒石酸铵为其最适氮源。生长速度大小顺序依次为cfcc6594菌株>cfcc6592菌株>cfcc84695菌株>cfcc83417菌株,而cfcc6594菌株菌丝体在酒石酸铵培养基上平均5.8 d可以长满平板培养皿。

表3 不同氮源培养基上菌丝体生长覆盖培养表面50%(A)、100%(B)所需的时间 d

2.2.3 添加松针水对松乳菇菌丝体生长的影响 添加松针水对松乳菇菌丝体生长的影响如表4所示。从表4中可知,添加松针水后各菌株的菌丝生长速度显著提升,可以在更短的时间内长满培养基面积的50%和100%,且添加松针水对接种后期的菌丝生长速度影响更大。其中cfcc 83417菌株的生长速度最快,仅需3.0 d便可以长满整个培养基表面,cfcc 83417菌株为最优菌株。

表4 添加松针水对松乳菇菌丝体生长的影响

3 结论

(1)不同菌株菌丝生长速度有所不同,其最适碳源、氮源有所不同;添加松针水可以有效提高4个菌株cfcc 6594,cfcc 84695,cfcc 6592和cfcc 83417菌丝的生长速度。其中,碳源和松针水对松乳菇菌丝生长速度的影响在接种前期小于后期。

(2)cfcc 83417菌株为最优菌株,平均3.0 d便可长满培养基表面,在最适培养基中生长速度显著大于其他菌株,其最适碳源为蔗糖,最适氮源为蛋白胨。故确定其最适培养基配方为KH2PO4(0.3 g)、MgSO4(0.5 g)、FeSO4(0.5 g)、蔗糖(19.9 g)、琼脂(20 g)、蛋白胨(1 g)、VB1(0.1 g)、松针水(1 000 mL)。

(3)cfcc 6592,cfcc 6594菌株的最适碳源为蔗糖,最适氮源为酒石酸铵,其最适培养基配方为KH2PO4(0.3 g)、MgSO4(0.5 g)、FeSO4(0.5 g)、蔗糖(19.9 g)、琼脂(20 g)、酒石酸铵(0.89 g)、VB1(0.1 g)、松针水(1 000 mL)。

(4)cfcc 84695菌株在葡萄糖碳源培养基上生长速度显著大于其他几个碳源培养基,酒石酸铵为其最适氮源,最适培养基配方为KH2PO4(0.3 g)、MgSO4(0.5 g)、FeSO4(0.5 g)、葡萄糖(20 g)、琼脂(20 g)、酒石酸铵(0.89 g)、VB1(0.1 g)、松针水(1 000 mL)。

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