松乳菇菌种固体培养基筛选初步研究

徐丽丽，郑华英，徐 明，解春霞，刘云鹏

(江苏省林业科学研究院， 江苏 南京 211153)

松乳菇[Lactariusdeliciosus(L.) Gray]属红菇科(Russulaceae)乳菇属，又名雁来蕈等，是松林山地的特产[1]。子实体中等偏大，乳汁量少，菌盖半球形，初生时菌盖边缘向下内卷，后平展，菌肉虾仁色，菌褶与菌盖同色，初略发白，后呈橘红色，伤后变绿色[1-2]。肉质细腻，味道鲜美、柔和，具独特风味，深受广大食客的喜爱，市场价格可达200元/kg[3-4]。松乳菇更是珍贵的药用真菌，具较高的医用价值[5-6]。具有极高的营养价值，富含多种人体所需的游离氨基酸、不饱和脂肪酸、粗蛋白、矿物质元素等，其根菌提出的松乳菇多糖，具有抗肿瘤、抗病毒、抑菌、调节机体免疫力等功效[7-9]。

松乳菇在中国广泛分布，以长江南岸的品质、口感最佳。但因其为松、杉、柏等植物根系的外生菌根菌，目前未见成功的人工驯化栽培，因而松乳菇的市场供应全依赖于野生人工采摘，这对松乳菇的野外生长环境破坏极大，致使其产量逐年下降[10]。由于其野外生长受自然因素(降雨量、温度、坡向)影响较大，松乳菇产量波动极大，易造成市场紧缺[11-12]。为保护食用菌资源的多样性，规模化开发利用松乳菇半人工栽培广受关注与研究[13-15]。规模化培养松乳菇菌丝体是其开发利用的先决条件，本文对松乳菇不同株菌进行了筛选，并对菌丝固体培养进行了初步研究，以期为后期其林下栽培与开发提供基础。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

试验菌株来自中国林业科学研究院菌种保藏中心菌种资源库，分别为cfcc 6592(山东济宁)、cfcc 83417(辽宁宽甸)、cfcc 84695(湖北)、cfcc 87505(陕西)、cfcc 6594、cfcc 6593和cfcc 7290。

1.2 菌株选择试验

基础培养基为实验室原有的松乳菇固体培养基，配方[16-17]组成为KH2PO4(0.3 g)、MgSO4(0.5 g)、蔗糖(19.9 g)、硝酸钠(0.82 g)、FeSO4(0.5 g)、琼脂(20 g)、VB1(0.1 g)、蒸馏水(1 000 mL)。将试管斜面培养的7个松乳菇保藏菌株活化培养，将活化后菌株直径为 5 mm的菌丝体，接种到基础培养基中央，置于25 ℃的恒温箱中培养，每种处理设重复5个。接种1 d后，每天观察菌丝形态，使用游标卡尺测量并记录菌落直径，以确定适宜的松乳菇菌株。

1.3 固体培养基配方筛选

碳元素在真菌细胞的干质量中占有一半，碳源在真菌发育过程中至关重要。本试验选取葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖等真菌培养过程中的常用碳源进行其最适碳源的选择[17]。通过相同含碳量换算，分别用蔗糖(19.9 g)、可溶性淀粉(18 g)、麦芽糖(20 g)、葡萄糖(20 g)作为碳源，配制成不同碳源的培养基，其他物质较基础培养基不变。使用筛选出的适宜菌株，取直径 5 mm的菌丝体，接种到供试培养基中央，置于25 ℃的恒温箱中培养，每个菌株各设4个碳源处理，每种处理设重复5个。接种1 d后，每天使用游标卡尺测量菌落直径并记录，计算出菌丝覆盖面达培养皿培养基表面50%、达培养皿培养基表面100%的天数。后续氮源及松针水的试验中接种方法、重复、培养温度、观察方法与此相同。

氮源在真菌生长过程中不可缺少。在完成碳源筛选的基础上，将最适碳源基础培养基中的硝酸钠(0.82 g)分别替用成蛋白胨(1 g)、酒石酸铵(0.89 g)、尿素(0.29 g)、谷氨酸(1.42 g)等氮源[17]，配制成不同氮源培养基，以含硝酸钠氮源培养基为对照，筛选出最适氮源。

最终培养基：使用适宜的氮源、碳源替换基础培养基中的碳源、氮源，并使用1 000 mL松针水替代基础培养基中等量的蒸馏水，配制最终培养基，接种菌丝体，以未添加松针水的最适碳源、氮源基础培养基作为对照。

2 结果与分析

2.1 不同松乳菇菌株菌丝体生长的比较

将供试菌株接种到培养基上，置于恒温箱25 ℃下培养。观察结果如表1所示，cfcc 6594，cfcc 84695，cfcc 6592和cfcc 83417菌株的菌丝体生长速度相对较快，在30 d内可以长满平板培养皿培养基表面，剩余其他菌株的菌丝体未能长满培养皿培养基表面。因此，选取这4个菌株进行后续试验。接种观察发现，不同菌株间菌丝生长速度有所不同，且基础培养基培养的菌丝较为稀薄，生长速度较慢，需要对基础培养基配方进行改良，使松乳菇菌种菌丝体可以高效生长。

表1 松乳菇不同菌株菌丝体生长时间比较 d

2.2 不同碳、氮源培养基上松乳菇菌种菌丝体生长的比较

2.2.1 不同碳源对松乳菇菌丝体生长的影响 试验结果如表2所示，不同碳源对松乳菇菌种菌丝生长情况的影响前期小于后期，后期差异更为明显。综合菌丝生长覆盖培养基表面达50%和100%的情况，发现cfcc 6592，cfcc 83417菌株在蔗糖碳源培养基上生长速度最快，cfcc84695菌株在葡萄糖碳源培养基上的生长速度最快。cfcc 6594菌株在麦芽糖碳源培养基上生长速度最慢，在30 d的观察期内，菌丝生长覆盖未达到培养基表面的50%，在蔗糖和可溶性淀粉上的生长速度显著大于葡萄糖，根据试验所得数值大小，以及试剂配制的便利性，选择蔗糖作为适宜碳源进行下一步氮源试验。在上述碳源上各菌株的生长速度大小顺序依次为cfcc 6592> cfcc 84695> cfcc 83417> cfcc 6594，而以菌株cfcc6592菌丝体生长最快，在蔗糖碳源培养基上，平均9.3 d可以长满平板培养皿培养基表面。

表2 不同碳源培养基上菌丝体生长覆盖培养基表面50%(A)、100%(B)所需时间 d

2.2.2 不同氮源对松乳菇菌丝体生长的影响 试验结果如表3所示，综合菌丝生长覆盖至培养基表面50%和100% 这2个指标，cfcc6592菌株菌丝体在以酒石酸铵为氮源的培养基上的生长速度较快，cfcc83417在以蛋白胨为氮源的培养基上的生长速度最快。cfcc6594，cfcc84695菌株在硝酸钠氮源培养基上生长速度显著小于其他4个不同氮源，其他4个氮源上的生长速度无显著差异，但在酒石酸铵上标准误较小，稳定性高于另3个氮源，因此选择酒石酸铵为其最适氮源。生长速度大小顺序依次为cfcc6594菌株>cfcc6592菌株>cfcc84695菌株>cfcc83417菌株，而cfcc6594菌株菌丝体在酒石酸铵培养基上平均5.8 d可以长满平板培养皿。

表3 不同氮源培养基上菌丝体生长覆盖培养表面50%(A)、100%(B)所需的时间 d

2.2.3 添加松针水对松乳菇菌丝体生长的影响 添加松针水对松乳菇菌丝体生长的影响如表4所示。从表4中可知，添加松针水后各菌株的菌丝生长速度显著提升，可以在更短的时间内长满培养基面积的50%和100%，且添加松针水对接种后期的菌丝生长速度影响更大。其中cfcc 83417菌株的生长速度最快，仅需3.0 d便可以长满整个培养基表面，cfcc 83417菌株为最优菌株。

表4 添加松针水对松乳菇菌丝体生长的影响

3 结论

(1)不同菌株菌丝生长速度有所不同，其最适碳源、氮源有所不同；添加松针水可以有效提高4个菌株cfcc 6594，cfcc 84695，cfcc 6592和cfcc 83417菌丝的生长速度。其中，碳源和松针水对松乳菇菌丝生长速度的影响在接种前期小于后期。

(2)cfcc 83417菌株为最优菌株，平均3.0 d便可长满培养基表面，在最适培养基中生长速度显著大于其他菌株，其最适碳源为蔗糖，最适氮源为蛋白胨。故确定其最适培养基配方为KH2PO4(0.3 g)、MgSO4(0.5 g)、FeSO4(0.5 g)、蔗糖(19.9 g)、琼脂(20 g)、蛋白胨(1 g)、VB1(0.1 g)、松针水(1 000 mL)。

(3)cfcc 6592，cfcc 6594菌株的最适碳源为蔗糖，最适氮源为酒石酸铵，其最适培养基配方为KH2PO4(0.3 g)、MgSO4(0.5 g)、FeSO4(0.5 g)、蔗糖(19.9 g)、琼脂(20 g)、酒石酸铵(0.89 g)、VB1(0.1 g)、松针水(1 000 mL)。

(4)cfcc 84695菌株在葡萄糖碳源培养基上生长速度显著大于其他几个碳源培养基，酒石酸铵为其最适氮源，最适培养基配方为KH2PO4(0.3 g)、MgSO4(0.5 g)、FeSO4(0.5 g)、葡萄糖(20 g)、琼脂(20 g)、酒石酸铵(0.89 g)、VB1(0.1 g)、松针水(1 000 mL)。