土家药豨签草的活性成分提取及其抑菌效果*

刘力玮,杨梦露,覃希榕,刘铭昱,唐振威,侯 娟,2

（1吉首大学医学院，湖南 吉首 416000；2吉首大学湖南省土家药研究中心，湖南 吉首 416000）

随着抗生素在临床医学上的广泛应用,病原体对传统抗生素类型药物的抗药性越来越明显,导致抗生素的在医学上的应用愈发局限性[1],并且传统抗生素药物对身体会产生副作用,现在人们开始逐渐关注中药的抗菌效果[2]。湘西动气候适宜,植物资源丰富,有着灿烂的医药文化,其中有一种名为豨莶草的土家族药材,具有祛风湿,通经络,清热解毒之功效[3],可以用来治疗黄疸,虫兽咬伤等疾病[4]。临床可用于祛风湿、利关节、抗炎、降血压[5-6]。豨签草中所含有的抑菌物质是一种豨莶碱类生物碱的成分。为了更加深入的研究豨签草生物碱成分的抗菌效果,从豨签草中提取了豨莶碱,采用常见的病原菌做实验进进行药物敏感性实验并对敏感菌的最小抑菌浓度进行检测[7-8]。本文拟以植物该的提取物为材料,以常见的病原菌为实验菌进行药物敏感性实验。研究粘草子中生物碱成分的抑菌效果,为进一步深入研究与应用提供科学依据。

1 实 验

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

供实材料豨签草材料于2018年6月15日采于湖南省湘西土家族苗族自治州吉首市矮寨乡德夯村(经度:109.57,纬度:28.34采摘）,经鉴定为菊科植物豨莶的全草,将带花果的豨签草全草放入恒温箱干,控温105℃干燥24 h,取出冷至室温用FZ-102植物粉碎机将干燥后的豨签草粉碎备用。

1.1.2 菌种与培养基

肺炎链球菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,枯草杆菌共5种标准菌,肉汤培养基、营养琼脂培养基,购于北京奥博星生物技术有限公司。

1.1.3 仪 器

电热恒温培养箱；光学显微镜；型恒温水浴锅；植物粉碎机；高压蒸汽灭菌锅。

1.2 实验方法

1.2.1 正交设计

将豨签草放入恒温箱干,控温105℃干燥24 h,取出冷至室温用植物粉碎机将干燥后的豨签草粉碎,然后准确称取粉碎后的黏草子。分别称取10 g豨签草以10∶1液料比获得浸提液。

1.2.1.1 醇提正交实验的设计

根据正交实验设计原理,总和单因素预实验结果,选取影响乙醇浸提豨签草浸提液抑菌效果的影响因素:乙醇溶液体积分数(Ⅰ）、浸提温度(Ⅱ）、浸提时间(Ⅲ）,实验因素与水平设计见表1。

表1 正交实验因素与水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

1.2.1.2 水提实验的设计

水提实验分为两组,第一组均用沸水分别浸提60、120、240、360 min；第二组:在第一组基础上,分别用60、70、80、90℃蒸馏水浸提。为保持温度,实验在水浴锅内进行。

1.2.2 方法及最小抑菌浓度的测定

根据上述1.2.1.1与1.2.1.2的方法获取豨签草的提取液,采用无菌盐水配置待试菌悬液。分别吸取0.2 mL的待试菌悬液放入到牛肉膏蛋白胨培养基表面上,然后进行均匀的涂抹,然后放入(37±0.5）℃的培养箱中干燥20 min,待琼脂凝结后,放入到恒温箱中,在(37±0.5）℃温度下进行培养1～2 d,观察细菌的生长情况。

图1 滤纸片法Fig.1 Filter paper method

采用滤纸片法进行对抑菌效果进行测定,如图1所示,采用直径为6 mm的灭菌滤纸片,放在豨签草提取液中浸泡2 d,然后使用无菌的镊子取出滤纸片然后放在含菌平板上,每皿放入7片,其中1张空白滤纸作为对照,其余6张均匀排列,每种菌做两组平行实验。

最小抑菌浓度(MIC）的测定:将无菌水在1.2.1.1与1.2.1.2获取提取液稀释成若干梯度的溶液,用灭菌移液抢吸取1 mL稀释的提取液放入要培养皿中,放入培养基,然后在分布吸取0.1 mL的各种各种供试菌菌悬液放入到培养皿表面,采用涂布棒将提取液均匀涂布,然后盖好培养皿,置于(37±1）℃温度下的恒温箱中培养18 h。采用无菌生长的浓度为最低抑菌浓度。以无菌生理盐水做空白对照[9]。

2 结果与讨论

2.1 醇提正交实验

乙醇提取豨签草浸提液抑菌实验结果见表2。从表2可知,不同水平组合下,抑菌环的大小存在明显差异。对于铜绿假单胞菌和大肠杆菌而言,Ⅰ1Ⅱ1Ⅲ1组合的抑菌环分别达到最大；而Ⅰ3Ⅱ3Ⅲ2组合对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌和枯草杆菌的抑菌环分别为最大。

表2 醇提抑菌正交实验结果Table 2 Orthogonal test results of alcohol extraction and bacteriostasis

2.2 水提实验结果

豨签草在60、120、240、360 min这几个时间段内用蒸馏水浸提所得浸提液的抑菌环直径变化趋势见图2。结果显示,在60、120、240 min两个豨签草提取液的浸泡时间会产生抑菌效果,2～4 h的时间段抑菌效果逐渐减弱,240～360 min的抑菌效果出现明显下降的趋势,浸泡超过360 min已经基本上起不到抑菌的作用。因此,当浸泡时间低于120 min,抑菌效果随着浸泡时间的增加而增强；当浸泡时间超过120 min后,抑菌效果开始逐渐下降,最后消失,因而水提实验采用n的浸泡时间为120 min。

豨签草在60、70、80、90℃ 4个温度梯度下用蒸馏水浸提120 min所得浸提液的抑菌环直径变化趋势见图3。结果显示,60、70℃下浸提液无抑菌现象。80、90℃下对5种菌均有抑菌现象,且80℃下抑菌环直径较大,90℃下抑菌效果显著下降。可见,80℃的温度能够更好地提取出豨签草中的抑菌物质,而90℃的温度过高,可能导致效应物挥发,故确定水提实验采用80℃的温度浸泡。

图2 不同水提时间抑菌环直径变化趋势图Fig.2 Variation Trend of diameter of bacteriostatic ring in different water extraction time

图3 不同水提温度抑菌环直径变化趋势图Fig.3 Variation Trend of diameter of bacteriostatic ring at different water extraction temperature

2.3 豨签草浸润提取液的最小抑菌浓度

表3 豨签草浸提液对各供试菌种的最小抑菌浓度Table 3 Minimum inhibitory concentration of the extract of Herba Siegesbeckiae

通过实验,豨签草水提液与醇提液均对各供试菌有良好的抑制效果。我们进而采取最小抑菌浓度实验法来进一步探究抑制作用和对各菌种最小抑菌的差异。实验结果如表3所示,此结果与上述研究结果一致,豨签草提取液对5种供试菌均具有抑制效果。由表3可知最小抑菌浓度下,豨签草水提取液对枯草杆菌的MIC值影响最大,豨签草的淳提取液对枯草芽孢杆菌的MIC影响较为明显,豨签草无论是水提取液和醇提液均对金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度均为最低,说明豨签草提取液对金黄色葡萄球菌的影响较为明显。在同种豨签草提取液浓度下,豨签草的醇提取液比水提取液抑菌效果更明显,可能是由于乙醇本身具有抑菌的作用,或者乙醇对豨签草的抗菌物质提取更明显。

3 结 论

通过研究发现,不管是粘草子的乙醇提取物还是水提取物对常见有害菌有抑制作用。本项中,粘草子醇提取物在醇浓度高,浸润温度和浸润时间较长的情况下对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和枯草杆菌在抑菌方面比较显著。

下一步值得探究的是将豨签草的提取物中各种成分进行分离并研究各种成分对抑菌效果产生的影响。虽然关于豨签草的研究很多,但是对于抑菌效果以及比较方面的研究却较少。本课题在现有的研究基础上,对土家族特色中药豨签草资源开展抑菌活性成分的提取,可带动以豨签草为原料的抑菌药物和保健品等市场的发展,拓广养生医药行业并带动当地经济发展,对中药材的开发有强大的引领作用。