沈阳地区50例听力损失儿童及其父母耳聋基因芯片筛查结果分析

王晶，惠莲

（中国医科大学附属第一院耳鼻喉科，沈阳 110001）

研究［1］发现，耳聋不仅可以由单一基因突变或不同基因的复合突变引起，也可以由环境因素（如医疗、环境暴露、创伤和药物等），或基因突变与环境因素共同作用导致。

KALATZIS等［2］和MORTON等［3］发现，遗传性耳聋中有75%～80%为常染色体隐性遗传，18%～20%为常染色体显性遗传，其余为X连锁遗传/线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）母系遗传或染色体疾病。我国遗传性耳聋患者涉及的主要是mtDNA、SLC26A4、GJB2和GJB3这4种基因的突变。其中，mtDNA基因突变主要包括1494M、1555M，SLC26A4基因突变主要包括IVS7-M、2168M，GJB2基因突变主要包括35M、176M、235M和299M，GJB3突变主要以538M为主。

基因检测手段在新生儿先天性耳聋筛查中日益得到推广［4］，基因筛查有助于确定高危人群，及早发现可能的晚发性听力损失，还可使患者及家庭成员获得更有效的基因咨询。本研究对沈阳地区50例听力损失儿童及其父母进行了耳聋基因检测，旨在了解该地区先天性耳聋患者的致聋基因类型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料：选择2018年1月至3月在潮州凯普生物化学有限公司进行耳聋基因检测的50个沈阳地区家庭，包括50例患儿及其父母，共150例受检者。患儿年龄5个月～13岁，女19例，男31例。

1.1.2 试剂和仪器：耳聋易感基因检测试剂盒（PCR+导流杂交法）由潮州凯普生物化学有限公司提供。ABI 9700 PCR扩增仪购自美国生物应用公司。

1.2 方法

抽取被检者静脉血2 mL于无菌抗凝管中（EDTA抗凝），立即低温保存送检。取100 μL血液样本提取DNA，取2 μL作为模板。利用生物素标记的引物对耳聋易感基因mtDNA、SLC26A4、GJB2和GJB3的突变部分进行特异性扩增，然后在导流杂交仪上将扩增产物与不同突变类型耳聋易感基因探针杂交膜进行导流杂交，通过化学显色对结果进行判读。

2 结果

2.1 患儿的耳聋易感基因检测情况

50例受检患儿中，共检出基因突变24例，阳性率48%。其中，GJB2基因突变11例（22%），SLC26A4基因突变13例（26%）。见表1。

表1 沈阳地区50例听力损失儿童基因检测结果Tab.1 The results of 50 hearing loss children gene tests in Shenyang

2.2 150例受检者的基因筛查结果

如表2所示，50个家庭（150例受检者）中，24个家庭（63例受检者）筛查结果阳性，其余26个家庭筛查结果阴性。63例筛查阳性结果具体如下：GJB2基因235纯合突变5例，235杂合突变20例，176杂合突变2例，299杂合突变1例；SLC26A4基因IVS7-2纯合突变3例，IVS7-2杂合突变19例，2168杂合突变10例，1229杂合突变2例，IVS7-2、1229杂合突变1例。GJB3基因和mtDNA基因突变在本组受检者中均为阴性。

3 讨论

耳聋是单基因疾病，具有高度遗传异质性。研究［5］认为，一半以上的先天性耳聋是由遗传性因素导致，还有一半的先天性耳聋是由于患者本身的基因缺陷所致，或者是由于基因缺陷和基因多态性造成对致聋环境因素的易感性增加而致病。

GJB2基因定位于人13号染色体，全长4 804 bp，有2个外显子，其编码区位为678 bp，编码外显子只有1个，编码产物为缝隙连接蛋白26（connexin 26，Cx-26）。Cx-26是缝隙连接蛋白家族的一员，主要在耳蜗的血管纹、基底膜、螺旋缘、前庭间质细胞、神经感觉上皮等处表达，在内耳非感觉细胞中也有表达。王辉兵等［6］认为，Cx-26蛋白是钾离子回流到内淋巴的通道，在维持耳蜗正常渗透压及听觉机制中起着不可替代的重要作用。GJB2基因突变可致Cx-26异常，从而导致耳聋［7-10］。GJB2基因是第一个被发现可导致常染色体隐性遗传性耳聋的基因［11］，纯合突变时发生耳聋，一般情况下，杂合突变不足以致聋，但也有文献［12-13］报道GJB2单杂合突变致聋。本研究中，纯合及杂合突变均可致聋。

表2 150例受检者的耳聋基因芯片筛查结果Tab.2 The results for 150 subjects deafness gene chip screening

SLC26A4基因编码Pendrin蛋白，该蛋白有12个跨膜区域。Pendrin蛋白在内耳的生理功能尚不明确，可能参与转运阴离子进出内淋巴液，维持内耳中内淋巴液系统的正常离子平衡状态［14］。SLC26A4基因突变可导致大前庭水管综合征和Pendred综合征［15］。文献［16］报道，耳聋基因芯片检测结果是SLC26A4杂合突变型的被检者为遗传性耳聋SLC26A4基因突变携带者。但在本研究中发现，SLC26A4基因纯合突变和杂合突变都可导致耳聋，应建议被检者亲属进行基因检测。

GJB2基因是最常见的致聋基因［17-19］。有文献［20］报道，我国最常见致聋基因突变为GJB2-235delC。第二位常见的耳聋突变基因是SLC26A4，临床上与大前庭导水管综合征直接相关［14］，中国前庭水管扩大人群SLC26A4基因突变检出率高达97%。携带SLC26A4基因突变的聋儿大部分是在外伤或感冒后出现听力下降，而且不可逆转［21］。但在本研究中，50例受检儿童中，SLC26A4基因突变阳性检出率为26%，是最常见的基因突变，而GJB2基因突变阳性检出率22%，为第二位。

mtDNA基因突变与非综合征性耳聋发生密切相关，突变主要发生于12SrRNA基因和tRNASer基因［22］，患者表现为对氨基糖苷类抗生素异常敏感。氨基糖苷类药物先后进入耳蜗和前庭，抗生素在这2个部位发生蓄积，之后氨基糖苷类抗生素与12Sr-RNA结合，最终导致细胞的损伤、凋亡，进而影响听力，因此12SrRNA基因上的某些突变是氨基糖苷类抗生素致聋的重要分子基础。mtDNA 12SrRNA基因突变是细胞质遗传，属母系遗传。研究［23］表明，由于mtDNA 12SrRNA基因突变而导致的耳聋患者有正常的耳蜗听神经，即使患者有重度的耳聋，也可以通过移植电子耳蜗恢复其听力。本研究中未检出mtDNA 12SrRNA基因突变。

GJB3基因是由夏家辉院士1998年在中国发现、定位并成功克隆的第一个耳聋基因［24］，该基因突变可致常染色体显性或隐性遗传性非综合征型耳聋。马占忠等［25］在韶关地区1 242例新生儿耳聋基因筛查中仅发现2例GJB3基因突变，由此可见，GJB3基因突变发生率较低。

本研究对沈阳地区50例耳聋患儿及其父母进行常见耳聋基因筛查检测，发现该地区耳聋患者的致病基因主要为GJB2和SLC26A4基因。其中GJB2耳聋基因235delC突变位点的检出频率最高，其次为176del16和299delAT，未检测到35delG和155delTCTG突变；SLC26A4基因检出频率最高的突变位点为IVS7-2A＞G，其次为2168A＞G、1229C＞T；未检测到mtDNA1494C＞T 和1555A＞G、7445A＞G、12201T＞G位点突变；未检测到GJB3538C＞T位点突变。