染色体核型联合微阵列分析应用于胎儿超声异常

孟雁欣 于湄 张静 杨玉秀

石家庄市第四医院产前诊断中心（石家庄050001）

研究报道约12.4%～35%胎儿超声异常由染色体畸变引起，染色体核型结构或数目异常约占25%，染色体微结构异常约占10%［1］。染色体核型分析技术以“胎儿来源细胞”为检测标本，被公认为检测染色体数目异常、大片段缺失/重复（>10 Mb）、重排、倒位等结构异常的遗传学产前诊断“金标准”。染色体微阵列分析技术（chromosomal microarray analysis，CMA）亦称为“分子核型”技术，包括比较基因组杂交的微阵列（array⁃based com⁃parative genomic hybridization，aCGH）及单核苷酸多态性微阵列（single nucleotide polymorphism arrays，SNP arrays），具备高分辨率（0.1～0.3 Mb）、高效率、高灵敏度等优势，可精确定位异常片段，显示受累基因，利于识别并鉴定疾病相关基因。2009年美国妇产科医师协会（ACOG）推荐将CMA用作产前胎儿超声异常检测，2013年ACOG及美国母胎医学会（SMFM）推荐将CMA替代传统染色体核型分析技术方法［2］。部分学者认为CMA不能检出平衡异位、倒位、<30%嵌合体及单基因疾病，检测结果分析复杂，短期内完全取代传统核型分析并不实际［3］。

我国2014年发布CMA产前诊断应用专家共识［4］，起步晚，缺乏完善的中国人群数据库等一定程度延缓它的发展进度。本研究回顾性分析47例超声结构异常胎儿的染色体检测结果，探讨分析染色体核型及CMA联合应用在超声异常胎儿中的临床应用价值，以及染色体结构/微结构变异与临床表型关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2016年1月至2017年12月因胎儿超声结构异常于石家庄市第四医院产前诊断中心就诊的妊娠女性47例。患者及家属明确产前诊断指征及意义后签署知情同意书。

1.2 介入性产前诊断 孕妇取仰卧位，常规消毒铺巾，超声定位穿刺部位。13例孕妇孕12周行绒毛穿刺术，由专人超声引导下经腹部或经阴道抽取妊娠12周绒毛组织25 mg；余孕18周后行羊水穿刺术，由专人经腹部抽取羊水30 mL。

1.3 实验室分析

1.3.1 传统染色体核型分析 绒毛细胞核型分析：取绒毛组织15～20 mg应用胰蛋白酶及胶原蛋白酶消化处理，采用长期培养法无菌平行独立培养。约9～10 d收获制片，进行常规G显带分析，镜下计数20个分裂相，分析3到5个分裂相，如果疑为异常核型或是嵌合体分析不少于50个细胞分裂相。

羊水细胞核型分析：抽取羊水10 mL，置于离心机中1 500 r/min离心10 min，弃上清液，加入羊水细胞培养基放置于37℃，5%体积分数的二氧化碳细胞培养箱中培养约5到7 d，收获前2 h加入10μL秋水仙碱，低渗，固定，制片，进行常规G显带染色体分析。显微镜下检测20个核型，分析3个核型，如果疑为异常核型或是嵌合体分析不少于50个细胞分裂相。

1.3.2 DNA提取 抽取15 mg绒毛/10 mL羊水，应用天根DNA提取试剂盒获得基因组DNA，Nano⁃Drop1000微量核苷酸蛋白多功能酶标仪（美国Gene公司）进行DNA含量测定。OD260/OD280比值符合DNA模板扩增需求。-80℃保存剩余绒穿/羊穿组织标本，拟用于后续位点验证等分子生物学分析。

1.3.3 CMA检测 实验反应流程参照Affymetrix公司提供的实验操作流程。研究应用美国Aff⁃ymetrix公司提供的全基因组Affymetrix CytoScan 750K Array芯片，该芯片包括200 000 SNP标记及550 000 CNV标记，平均1个标记/4 kb的密度（未覆盖全染色体基因组所有位点）分布于人类的整个基因组，可以检测全基因组有临床意义的染色体微缺失/微重复和染色体亚端粒缺失综合征等异常染色体拷贝数变化及杂合性缺失。检测结果与下列公共数据库进行比对分析：http：//omim.org/（OMIM数据库）；http：//genome.ucsc.edu/（UCSC数据库）；http：//ncbi.nlm.nih.gov/pubmed（NCBI数据库）；https：//decipher.sanger.ac.uk/（DECIPHER数据库）。

2 结果

2.1 临床病例分析 孕妇年龄22～45周岁，依据末次月经及孕早期超声核实孕妇孕周，孕周11～33周。参照美国疾病控制中心出生缺陷及遗传疾病科使用的分类标准，以受累器官系统畸形进行分类［5］。9例单系统结构异常合并其他系统异常。本研究47例孕妇行产前诊断，8例染色体核型变异，5例CMA变异孕妇选择终止妊娠，8例染色体核型及CMA阴性胎儿生产，产后3个月随访无异常。26例孕妇胎儿染色体核型分析未见异常，动态超声观察，孕晚期进行超声情况及产后随访：2例失访；5例足月顺产（4例女孩，1例男孩），至产后3个月随访未见异常；4例行剖宫产（2例羊水多剖宫产术后送往专科医院手术治疗后3个月未见异常）；1例透明隔腔未显示，男婴产后3个月颈部力量差；1例产后3个月未见异常。余13例引产胎儿中，1例小脑延髓池及侧脑室增宽胎儿FL/BPD比值异常，胸廓窄小考虑成骨发育不全行相关基因检测示FGR，exon7，c.764C>G；1例考虑超声及MRI提示肾囊肿当地引产，2例孕晚期胎停育；9例孕晚期超声示逐渐加重放弃继续妊娠。

2.2 染色体核型分析 47例孕妇进行染色体核型分析，检出率约16.8%（8/47），致病率14.9%（表1），包括21⁃三体4例，性染色体异常2例（含1例嵌合），平衡异位1例，衍生染色体1例，其中46，XN，t（6：18）（p10：q10）核型胎儿源于父亲；46，XN，der（1）t（1：2）（q44：p24）核型胎儿源于母亲，余夫妇双方染色体未见异常。

8例核型异常样本，6例颈部异常（4例<13+6周，2例>14周），包括21⁃三体2例，性染色体异常2例（含嵌合1例），平衡异位1例，衍生染色体1例；余两例分别为颈部合并心脏异常及单独心脏结构异常，核型结果21⁃三体。

2.3 CMA检测分析 13例染色体核型正常及2例核型异常（1例性染色体嵌合及1例常染色体衍生）孕妇了解CMA适应症、风险及检测意义后继续CMA检测，7例微结构变异［2例染色体核型分析异常（1例性染色体嵌合及1例衍生染色体）］，变异率提高约10.5%（5/47），明确致病率提高约6.4%（3/47）。

检测到的11个拷贝异常位点中，2例颈部超声异常胎儿（1例性染色体嵌合及1例常染色体衍生）检测出4个拷贝异常，2个归类为致病位点；新发检测的1q44未查询到明确疾病报道，归类为VOUS；1例超声颈部异常但染色体核型未见异常胎儿CMA结果检出6q26片段异常，与青年帕金森病相关但目前未发现与本研究胎儿超声表型相关报道，归类为可能良性位点。

3例临床小于孕周胎儿染色体核型均未发现异常，CMA共检测出5个拷贝异常，4个已报致病意义位点，2个位于性染色体，2个位于常染色体；位于常染色体的7q36.3区域缺失引起的Currarino综合征及LGMD型肌营养不良与胎儿临床表型无明确相关性，归类可疑良性位点。

1例胸腹腔积液胎儿染色体核型未见异常，CMA检测到两个拷贝异常位点，1q22区域缺失与肾髓质囊性病及先天性糖基化异常1型有关，数据库报道先天性糖基化异常1型可表现各脏器积液或发育迟缓，但与胸腹腔积液报道超声影像表型报道较少，归类为可疑致病位点；2q13区域重复与Joubert综合征有关，与本胎儿表型无相关性，归类为可能良性。

表1 胎儿染色体及片段异常类型Tab.1 Karyotype and CMA findings in relation to indications for testing fetuses 例（%）

3 讨论

3.1 染色体核型分析联合CMA在胎儿超声结构中的临床应用 传统染色体核型分析用于染色体结构及数目检测。本研究47例胎儿应用传统染色体核型分析明确8例核型异常，包括非整倍体、性染色体嵌合、平衡易位及衍生染色体结构变异，但该方法对微小片段敏感性低易导致漏筛。CMA作为高分辨率、高效率分子生物学检测方法，能检测到传统染色体核型无法检测的<50 bp微小片段，变异检出率显著提高。笔者在染色体核型分析技术基础上联合CMA技术检测提示5例核型阴性胎儿检测出染色体微结构变异，检出染色体变异率提高了10.5%，明确致病比例提高了6.3%。这一结果与既往CMA检测能显著提高染色体疾病变异率报道一致，但略高于HILLMAN等［6］报道指出的CMA将染色体核型正常但超声结构异常胎儿病例明确致病率高于3%～5%的结论。与ANITA等报道一组香港人群研究中将诊断率提高12%～15%结果一致［7］。笔者考虑这与亚洲人群种族、地域差异性有关，同时本研究异常超声表型局限，不除外入组病例数量少有关，后续研究笔者将继续增加异常超声表型数目及入组病例数。除此之外，1例明确性染色体嵌合胎儿继续行CMA检测微结构变异提示男性无精/少精引起的不育症有关［8⁃9］；1例胎儿衍生染色体行CMA明确了片段来源性质及区带定位，结果提示与2p25.3p24.3引起的CHARGE综合征有关［10］。上述微结构变异均与国际数据库已报染色体微结构变异与异常超声表型报道一致，为遗传咨询提供了有效信息。然而，实际临床工作中CMA短期内并不能完全取代传统染色体核型分析方法在产前诊断中的应用［11］。究其原因与CMA检测及亲缘验证费用高，地方普及该类检测存在困难，复杂检测数据结果解读对临床医生专业水平要求较高；其次，CMA不能检出倒位及低比例嵌合体、平衡异位重排信息、单基因等遗传致病因素。笔者认为产前诊断中，将染色体核型分析与CMA联合用于超声异常胎儿的检测，对于核型分析未发现染色体异常病例进一步行CMA检测可以明确染色体微结构变异致病风险；对于核型分析发现标记染色体或衍生染色体的病例，进一步进行CMA检测，可以明确来源，对精准产前诊断有重要意义。

3.2 染色体变异与胎儿产前超声异常相关性分析 产前诊断依靠产前超声对胎儿结构及比例关系、外形轮廓变化、某些特殊征像等来评判胎儿预后及复发风险。报道指出产前超声检出胎儿结构异常越多，胎儿罹患染色体病风险越大［12］。准确评估超声表型与各畸形相关染色体异常类型或不同类型染色体异常与可检测超声畸形关系至关重要。颈部异常［颈部淋巴瘤（nuchal translucency，NT）>0.25 cm，NF>0.60 cm］是公认的较早超声遗传学指标。Nicolaides指出早孕期和中孕早期，胎儿颈部超声异常表型是目前提示胎儿染色体异常最敏感和最特异的超声指标［13］。PANDYA等［14］对1 015例因早孕期NT增厚进行染色体检测证实NT增厚发生染色体三体的风险较高龄孕妇增加。20世纪80年代，许多研究报道中孕期胎儿颈部异常与非整倍体染色体异常，尤其性染色体异常有关。除与染色体三体相关报道外，一项NT增厚染色体核型正常报道证实NT异常与染色体微结构异常相关。本研究颈部异常染色体核型变异率占14.9%（包括性染色体、21⁃三体及其它常染色体），微结构变异率占2.1%，证实颈部异常不仅是21⁃三体有效标志，亦是其它染色体缺陷的有效标志，染色体致病率高，与既往报道一致。

本研究6例胎儿小于孕周（small for gestation⁃al，SGA），3例染色体核型未见异常，3例检测出4个微结构变异，分布于性染色体及常染色体上，均有胎儿发育迟滞致病报道。虽然超声表型均为SGA，但临床表型、预后各有差异。如Xp22.33区域缺失仅表现四肢发育异常，余片段变异均伴有不同程度智力及语言障碍；该片段变异引起的发育迟滞给予重组人生长激素治疗可得到有效缓解［15⁃16］；Xq22.3q28区域重复因内含FMR伴性腺发育异常等。除表型等差异外，对复发风险评判亦有所差别，如X染色体微结构变异多遗传自女方携带者，女方多无任何临床表现［17⁃18］。目前国内SGA与染色体微结构异常报道甚少，建议重视SGA患儿染色体微结构检测。同时，我们认为“遗传异质性”的存在对超声表型有影响，笔者染色体及微结构变异致病时，应明确片段长度、内含致病基因及来源。

3.3 CMA在产前咨询中的应用 CMA技术可谓是产前诊断的一把“双刃剑”，对小片段敏感性能增加检测结果阳性率，降低染色体病缺陷患儿的出生，更可作为遗传评估手段用于辅助生殖，使家庭再次生育健康孩子的愿望得以实现；但临床意义不明或是复杂突变结果会导致孕产妇焦虑，甚至错误终止妊娠；能否准确无误对大数据检测结果给予正确判读给临床咨询医生专业能力也提出了挑战。本研究共检测出11个拷贝变异位点，经数据库比对分析，亲源染色体比对后，参照美国ACMG指南中将CMA检测结果分为致病性、可能致病、未知意义的、可能良性和良性的分类方法进行微结构变异分类［2］。6个位点已有既往致病报道，且与临床表型一致，归类为致病位点。新发的1q44区域缺失目前未发现内含致病基因，归类为未知意义位点（variant unknown significance，VOUS）。对于这一类微结构变异位点，不能完全排除致病意义，可能存在新发或罕见性，亦或是多变外显率。6q26区域缺失、7q36.3区域缺失及2q13区域重复片段内都涉及基因，但与本研究入选病例临床无明显相关性，归类为可能良性位点［19］。1q22区域缺失内含的DPM3与先天性糖基化异常1型相关，引起多脏器积液、损害及发育迟缓。与本研究临床表型存在相关性，故归类为可疑致病位点。当然完善胎儿产前咨询的同时有效的病例随访对于特殊微结构变异位点有重要意义，同时应将更多的特殊产前病例提交给ISCA/DEFAPHER数据库，以构建良好的交流平台。

综上所述，笔者认为将传统染色体核型分析与CMA共同用于超声结构异常胎儿染色体病检测，二者“取长补短”，可以显著提高检出阳性率，充实中国人群CMA数据库，明确致病结构、片段来源及致病性，有效指导临床产前咨询并制定科学合理的诊疗方案。