昆明10种草坪草的ISSR指纹图谱构建

王开拓　吴田　蓝增全

摘要：草坪业在发展过程中出现一些种的混淆，为了区分不同草坪草，采用昆明常见的10种草坪草为样本，利用简单重复序列（inter-simple sequence repeat，简称ISSR）分子标记技术构建昆明地区常见草坪草的指纹图谱。从28条引物中筛选出15条特异性较好的引物，对其进行退火温度筛选。结果表明，引物UBC834、UBC842、UBC844退火温度分别为58、58、55 ℃时多态性较好。对引物UBC834、UBC842、UBC844的電泳图谱进行0、1读带，构建了3个草坪草的数字指纹图谱，可以将供试的10种草坪草全部区分开来。

关键词：草坪草;ISSR;指纹图谱;多态性

中图分类号：S688.401

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）02-0073-04

收稿日期：2019-07-15

作者简介：王开拓（1992—），男，安徽淮南人，硕士研究生，主要从事植物遗传与种质资源研究。E-mail：809271790@qq.com。

通信作者：吴 田，博士，副教授，主要从事植物分子生物学研究，E-mail：461257271@qq.com;蓝增全，硕士，教授，主要从事生态学研究，E-mail：kmlanzengquan@qq.com。

近年来草坪业在我国发展迅猛，特别是在城市绿化和一些运动场中应用极为广泛，对人类赖以生存的生活环境起着保护、美化和改善作用。而昆明地处我国西南地区，气候独特，四季如春，素有“春城”的美称。陈蕴等对我国草坪草的引种工作和一些主要问题进行了综述和分析[1]。彭燕等以我国主要草坪草的研究进展为基础，提出研究和利用草坪草种质资源的对策[2]。黄鹤平等选用10个草坪草品种进行栽培研究，对昆明地区的草坪草引种进行了评价[3]。昆明市对城市的美化正在不断地加强，对草坪草的数量和质量要求也不断提高。但是，由于草坪草经修剪后通常叶色、叶宽、叶片硬度等均会发生变化，且没有花序，因此难以通过植物学性状区分草种，不利于有针对性地对草坪进行养护管理。而通过构建某一地区常见的草坪草DNA指纹图谱，为后续的草种分辨提供了途径。

微卫星DNA（simple sequence repeats，简称SSR）、限制性长度片段多态性（restriction fragment length polymorphism，简称RFLP）、随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，简称RAPD）等分子自标记技术均可以构建指纹图谱，它们都从不同的角度反映物种的遗传信息[4-7]。简单重复序列（inter-simple sequence repeat，简称ISSR）是一种基于PCR扩增进行检测的分子标记技术，它对简单重复序列之间的区域进行多态性扩增，是由Zietkiewicz等[8]提出的。ISSR结合了其他分子标记技术的特点，如操作简单、稳定性好、多态性丰富、成本低等[9-10]，为指纹图谱的构建提供了快速可靠的技术基础。指纹图谱是品质混杂的检测工具[11]，利用ISSR分子标记技术构建指纹图谱在品种鉴定上的应用越来越广泛，前人已经在苹果[12]、桑树[13]、凤梨[14]、复烤烟[15]等多种植物材料上建立了指纹图谱。在草坪草上，刘君等利用ISSR标记技术对9份狗牙根的遗传多样性进行了研究，构建了9份材料的指纹图谱[16]。胡雪华等以上海结缕草（Zoysia japonica）JD-1和细叶结缕草（Zoysia tenuifolia）、沟叶结缕草（Zoysia matrella）、结缕草为材料，利用ISSR分子标记技术在4个材料中构建了指纹图谱[17]。本试验以昆明常见的10种草坪草为材料，利用ISSR分子标记技术构建指纹图谱，为后续从分子角度对其进行相互区分奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用草坪草材料分别为沟叶结缕草[Zoysia matrella （L.） Merr.]、结缕草（Zoysia japonica Steud.）、细叶结缕草（Zoysia tenuifolia Willd. ex Trin.）、黑麦草（Lolium perenne L.）、高羊茅（Festuca elata）、草地早熟禾（Poa pratensis L.）、紫羊茅（Festuca rubra L.）、细弱剪股颖（Agrostis tenuis Sibth.）、匍匐剪股颖（Agrostis stolonifera）和狗牙根[Cynodon dactylon （L.） Pers.]。将其种子在西南林业大学园林学院实验室温室培养箱中于 25 ℃ 光照培养发芽。

1.2 DNA提取与检测

每个草坪草品种剪下由多颗种子萌发的幼嫩叶片进行液氮研磨，使用TIANGEN试剂盒提取总DNA。对提取的DNA原液进行1.0%琼脂糖凝胶、GoldView核酸染料电泳，检测其质量。保存在 -20 ℃ 冰箱中。

1.3 ISSR-PCR反应体系及扩增条件

本试验所用PCR反应体系为25 μL：ddH2O 18 μL，dNTP 2 μL，10×Buffer 2.5 μL，DNA模板100 ng，引物10 μmol/L，Trans Taq DNA聚合酶 0.5 μL。扩增程序为94 ℃预变性3 min;94 ℃变性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，40个循环;72 ℃ 再延伸10 min，4 ℃保存。

ISSR引物筛选。PCR反应结束后，将扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中检测。电泳条件为上样量 3 μL，1×TAE缓冲液，90 V电压下45 min。电泳结束后在凝胶成像系统上观测、拍照。用10个草种样本从28条引物（表1）中筛选出条带清晰、多态性高以及重复性好的引物。