畜禽肉组织中恩诺沙星残留酶联免疫检测方法探讨

陈 浩，王道伟

吉林省公主岭市苇子沟畜牧站，吉林公主岭 136100

恩诺沙星是喹诺酮类抗菌药，因其能抑制细菌DNA 螺旋酶，抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，已成为兽医临诊和水产养殖中最重要的抗感染药物之一，被大量用于治疗、预防和促进生长。由于其耐药性和潜在的致癌性，欧盟、日本及我国均制定了在组织中的最高残留限量。本方法参照农业部1025 号公告—25—2008 和试剂盒相关材料，通过规范各检验步骤，达到了较好的分析结果。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

酶标仪(ThermoFisher)、高速冷冻离心机(ThermoFisher)、氮吹仪、涡旋仪(1NA)、振荡器(1NA)。

1.2 药品试剂

试剂盒提供。

2 样品处理

2.1 称取均质后的组织样本于50 mL 离心管中，加入氢氧化钠溶液，充分振荡混匀10 min，5 000 转离心10 min。

2.2 取4 mL 上清液至新的50 mL 离心管中，分别加入4 mLO.2M 磷酸盐缓冲液和8 mL 二氯甲烷，振荡10 min，5 000 转离心10 min。

2.3 除去上层，取6 mL 下层有机相至l0 mL 干净玻璃管中，55 ℃水浴氮气吹干。

2.4 加入l mL 复溶工作液，涡旋2 min 溶解干燥的残留物，加入l mL 正己烷，涡旋2 min，5 000 转离l0 min。

2.5 除去上层正己烷及中间层杂质，取下层50 μL用于分析。

3 试剂盒操作

3.1 加入标准晶及样品到对应的微孔中，加入酶标二抗50 μL，再加入抗体工作液50 μL，轻轻振荡混匀，用盖板模盖板后于25 ℃避光放应60 min。

3.2 洗板：小心揭开盖板模，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250 μL/孔，充分洗涤5 次，每次间隔10 s，甩掉孔内液体，用吸水纸拍干。

3.3 显色：加入底物液A 液50 μL/孔，再加入底物液B 液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板模盖板后于25 ℃避光放应30 min。

3.4 测定：加入终止液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于430/630 血处检测，在添加回收结果5 min 内读取数据。

4 数据结果

4.1 标准溶液浓度：O、0.5 、1.5 、4.5 、13.5 、40.5 ng/mL。

4.2 添力口浓度：lO L、20 、30 ng/mL。

4.3 此方法的稀释倍数：2。

4.4 标准曲线线性：以标准品百分吸光率为纵坐标，以恩诺沙星标准晶浓度的对数为横坐标，经软件绘制曲线。相关系数R2=O.9945，线性良好。

5 讨论

5.1 样品前处理

5.1.1 称样要尽量准确，当样品量不为3.00 g 时，计算添加浓度要算进质量数。

5.1.2 在空白肉中加入标准后，要涡旋后静置5 min，令标液渗入组织中。

5.1.3 离心要充分，本试验选择提高转速与时间来保证液体的充分分离。

5.1.4 离心管结实密封性好，由于离心后要加入二氯甲烷有机试剂，为防止振荡时液体流出，应选用高品质的离心管。

5.1.5 要吸去上层水相后再吸取6 mL 下层有机相，不应直接伸进下层取液，否则会带入部分水相影响吹干效果。

5.2 试剂盒操作

5.2.1 吸取标准及样品时，移液枪可以选择吸二打一(一档进一档出)，也可以吸一打二(一档进二档出)，但在吸液量小于等于20 μL 时应选择吸一打二，避免有气泡。

5.2.2 吸液前枪头要润洗2 ～3 次，排除液体的表面张力，润洗液要弃去。

5.2.3 吸液时枪头要垂直于微孔，不要碰到孔壁，更不要碰到孔底部。吸液要准确，尽量使两孔平行。5.2.4 洗板时有气泡可用干净的枪头戳破，只戳破气泡即可，不要碰到孔的底部影响结果。每个气泡要换新的枪头。

5.2.5 甩干时可直接将板垂直倒过来停留一会再拍干，防止液体的交叉污染。

5.2.6 加完终止液后要在5 min 内及时上机测定。

5.3 添加计算

一般添加浓度要在标准曲线浓度的范围内，最好在整个曲线的中部。所以选择添加浓度是要先除以稀释倍数后令其落在曲线中部即可，通过高标浓度值及称样量等计算出添加体积数。

目前在实验室畜禽肉中恩诺沙星的检出率还是有一定比例，可能与对养殖户兽药应用知识的宣传普及不到位有关，各种兽药在动物体内的残留时间不同。恩诺沙星的排泄主要通过肾脏，其次通过胆汁排出，鸡体内的恩诺沙星消除比较缓慢，其休药期为12 d。