结核分枝杆菌抗原蛋白研究的新进展

王烁程，任清丹，陶晨璐，孙 旭

1.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春 130118；2.吉林省畜牧总站，吉林长春 130051

结核病是由分枝杆菌感染引起的一种人畜共患慢性传染病。牛结核病在我国被归类为二类动物疫病，据调查：山东省2012 年规模化奶牛场牛结核病阳性率为14.93%；河南省2018 年规模化奶牛场牛结核病阳性率为8.55%。说明我国的牛结核病疫情形势严峻，给畜牧业带来了巨大的经济损失。患病牛会形成肺空洞并与支气管相连，其呼吸道分泌物产生气溶胶引发感染。除此之外，患病动物体内各个器官均有病灶，病原菌通过污染饲料、牛奶、饮水、粪便、尿液在其他动物之间传播，因此MTB感染在梅花鹿、驯鹿、猪、猴等动物中也常有发生[3]。随着人民生活水平的不断提高，人们对新鲜牛奶的需求加大，促使我国的奶牛饲养规模逐年升高。然而我国的奶牛饲养目前仍以小规模农场饲养为主，由于MTB 对外界环境具有较强的抵抗力，在土壤中可存活7 个月，奶中存活90 d，因此卫生条件差，饲养密度大，饲养管理不良，牛舍潮湿，防疫措施欠缺的饲养环境易引起牛结核病的发生。

感染MTB 的病牛在感染初期时，可能不出现临床症状，通常呈慢性经过。进入活动期后，病牛常发肺结核，出现易疲劳、逐渐消瘦等症状，同时结核结节与干酪样钙化病灶会出现在多种组织器官上。有的病牛肩前、股前、颌下等体表淋巴结肿大。纵隔淋巴结肿大后，压迫食道，会出现慢性胀气症状。病势恶化后，可能引发全身性结核。此外多数病牛乳房常被MTB 感染侵害，泌乳量减少，乳汁稀薄。生殖器官结核会出现性机能紊乱，发情频繁，孕畜流产等现象，对养殖业危害极大。目前牛结核病的诊断普遍采用结核菌素（PPD）试验和间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。PPD 的优点是方法简便，但其是MTB 的纯蛋白衍生物，可能存在交叉反应。而ELISA 在检测时如果病原菌的抗原性较弱，则检测的准确率会受到影响。本文将对目前研究较少但在MTB 血清学诊断方面具有潜在价值的MTB 保护性抗原蛋白的最新研究进展进行综述。以期对牛结核病诊断方面的研究提供参考。

1 PE/PPE 家族

PE 和PPE 是MTB 抗原中两个不同家族的蛋白，但却有着千丝万缕的联系，均富含脯氨酸（Pro）和谷氨酸（Glu），目前研究证实PE 家族蛋白只存在于致病MTB 中，推测该家族蛋白可能与免疫逃逸（病原体通过其结构和非结构产物，拮抗、阻断和抑制机体的免疫应答）相关。目前发现PE/PPE 家族蛋白表达于细胞表面，这说明该类蛋白在MTB 与宿主的相互作用中发挥重要功能。PE 家族主要可以分为两大类：PE 亚家族和PE_PGRS 亚家族。PE 家族都具有由110 个氨基酸残基组成的N 端结构域，而PPE 亚家族又分为四个亚族。其中PE25蛋白（Rv2431c）和PPE41（Rv2430c）由一个操纵子编码共同转录，当PE35 和PPE41 分别在大肠杆菌工程菌中重组表达时，二者均为包涵体沉淀，而共同表达时则形成可溶二聚体，说明两个家族蛋白间存在相互协作。PE 家族主要蛋白如PE7 蛋白（Rv0916c）、PE11 蛋白（Rv1169c）、PE22 蛋白（Rv2107）、PE25 蛋白（Rv2431c）均不位于RD区，且都不是H37Rv 体外生长所必需的，仅PE35（Rv3872）蛋白和PPE68（Rv3873）蛋白位于RD1 区。皮下注射MTB H37Rv 感染C57BL/6 小鼠三周后检测小鼠脾淋巴细胞对PPE68、PE35 蛋白多肽反应产生的INF-γ 水平，发现PPE68 的免疫原性要高于PE35。众所周知，RD1 区是目前MTB 基因组研究较深入的区域，其中的CFP-10（Rv3874）和ESAT-6（Rv3875）一直被认为是MTB 最重要的两个保护性抗原，而对于PE35 蛋白的研究却呈现出完全相反的观点，有研究认为PE35 蛋白与CFP-10 和ESAT-6 相比仅具有较弱的血清学反应，但也有相关研究认为PE35 蛋白相比CFP-10 和ESAT-6有更强的体液免疫反应。PE35 蛋白作为抗原会出现如此相反的结论，推测可能是因为PE 家族蛋白是表达于细胞表面，MTB 在感染和生长的不同时期通过调节PE 蛋白的表达与宿主相互作用，在不同时期表达量的差异影响了其在免疫反应中的作用强弱；另一方面，通过对PE/PPE 蛋白的抗原表位进行研究发现，不同菌株BCG 中的PE/PPE 基因家族编码的抗原表位会发生基因水平的变异。由此看来，PE/PPE 家族蛋白在作为抗原检测MTB方面可能存在稳定性不足的缺点。实际上，目前对于PE/PPE 系列蛋白的研究尚浅，对于该系列的大部分蛋白的功能有很多假说，如PE11（Rv1169c）可能具有能量供应方面的功能；PPE46（Rv3018c）功能尚不清楚，可能是MTB 的毒力因子；PPE55（Rv3347c）能在H37Rv 感染后30 d 的豚鼠肺中检出，但不是H37Rv 生长所必需。通过对PE35、PPE68 在血清学诊断方面的结果来看，PE/PPE 家族系列蛋白可能成为用于TB 诊断的新抗原。

2 RD 区蛋白

2.1 RD4 区蛋白

在MTB 的16 个RD 区中，RD4 区仅有3 个基因（Rv0221、Rv0222、Rv0223c），且该区域在BCG和牛分枝杆菌中均缺失，说明该区域基因有区分鉴别牛分枝杆菌和MTB 的价值，但在蛋白方面Rv0221编码的蛋白为甘油三酯酶，其参与甘油三酯的合成；Rv0223c 编码的蛋白为乙醛脱氢酶催化乙醛脱氧生成乙酸，二者均不是MTB 生长所必需的基因，也不具备血清学诊断价值，仅适用于胶体金等分子生物学诊断方法。而有研究发现，Rv0222 蛋白（又称echA1 蛋白）具有较高的血清学诊断价值，且不受人类免疫缺陷症（Human Immunodeficiency Virus,HIV）患者的影响（目前HIV 患者合并TB现象会直接降低PPD 和痰菌的阳性率）。在利用Rv0222/ESAT-6 融合蛋白检测HIV 阳性的TB 患者的发现，该融合蛋白的检出率达到了61%，说明Rv0222/ESAT-6 融合蛋白在诊断HIV 阳性TB 患者方面有很高的敏感性。

2.2 RD5（Rv3117）

通过测定不同浓度的Rv3117 蛋白刺激TB 患者释放IFN-γ 水平显示，重组Rv3117 蛋白并不能刺激患者产生IFN-γ，其并没有血清学诊断价值，但Rv3117 基因仅存在于致病性MTB 中，两者对于MTB 的致病性研究具有一定意义。

2.3 RD6（Rv1515c、Rv1508c）

Rv1515c 属于MTB 中的一个保守基因，定位在细胞壁。研究发现Rv1515c 蛋白能够提高耻垢分枝杆菌的环境耐受力，提高其在巨噬细胞内的存活率，Rv1515c 基因会下调IL-6、IL-10、TNF-α的mRNA 水平，而IL-10、TNF-α 是分枝杆菌肉芽肿形成的关键因子。说明Rv1515c 蛋白与MTB在体内肉芽肿的形成相关，并且参与MTB 的微环境调控，但作用机制尚不明确。对RD6 区另一个基因Rv1508c 研究发现，该基因只存在于H37Rv 和H37Ra 中，并且该基因会促使MTB 对链霉素敏感，强化链霉素对MTB 的杀伤作用，说明该基因有增强抗结核药物敏感性的潜力。

2.4 RD9 区（Rv3619c）

Rv3619c 蛋白由位于RD9 区的Rv3619c 基因编码，通过对PE35、PPE68、CFP-10、ESAT-6、Rv 3619c 五种蛋白的研究发现，这五种蛋白均能诱发迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity,DTH），但PE35、PPE68、CFP-10、ESAT-6 仅在MTB 组中引起DTH 阳性反应，而Rv3619c 在MTB和BCG 组中均能引起DTH 阳性反应。同时发现Rv3619c 蛋白会与Rv3620c 蛋白形成异源二聚体复合物，其结构与ESAT-6-CFP-10 的复合物结构类似，并且在酸性环境中不稳定。使用Rv3619c 重组蛋白注射小鼠发现，IFN-γ、IL-2、IgG 水平均升高，说明发生了Th1 反应，证明Rv3619c 有成为亚单位疫苗的候选物的潜力。

2.5 RD11 区蛋白（Rv3425、Rv3426、Rv3429）

PPE57(Rv3425）、PPE58（Rv3426）、PPE59（Rv3429）蛋白是前文所提到的P P E 家族蛋白，编码这三个蛋白的基因均位于RD11 区，且这三个基因在BCG 和环境分枝杆菌中均缺失，都不是MTB H37Rv 体外生长所必需，说明这三个蛋白可能与致病性相关。重组PPE57 蛋白应用ELISPOT 检测 活动性TB 的灵敏度为59%，其能够诱导强的体液免疫和细胞免疫，且能够区分BCG 免疫者。与PPE57 蛋白相似，重组PPE58 和PPE59 蛋白在血清学诊断方面均具有较高的灵敏度，在区分BCG 免疫着方面均具有较高的特异性，说明以上三个蛋白在提高PPD 检测准确率方面具有潜在价值。

2.6 RD12（Rv2074）

目前对于RD12 区蛋白研究较少，一般认为RD12、RD13 区的蛋白可能和TB 的发病机理相关。有研究对RD12 区的Rv2074 蛋白的结构进行研究发现，该蛋白的晶体结构与大肠杆菌和人的磷酸吡哆醇氧化酶（pyridoxine 5’-phosphate oxidase,PNPO）具有广泛相似性，说明Rv2074 可能参与维生素B6的合成。通过酶联免疫斑点试验检测血清抗体发现，Rv2047 蛋白在TB 患者和健康对照组中并无显著差异，说明该蛋白不具备血清学诊断价值。

2.7 RD13 区（Rv2645）

有研究对RD10 ～14 区的22 个蛋白的进行研究发现，RD13 区Rv2645 基因编码的Rv2645 蛋白在免疫小鼠脾细胞48 h 后，能够产生能够产生较高水平的IFN-γ。用该蛋白刺激TB 患者的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）发现，在TB 病人中产生的IFN-γ 又高于健康人，并且Rv2645 能够引发迟发型超敏反应，能够区分iH37Rv 预免疫小鼠和BCG 小鼠，说明其能够区分BCG 免疫和TB 感染人群，而目前PPD 不具备此区分功能，说明该蛋白有提高PPD 诊断效果的价值。

2.8 RD16（Rv3403c）

通过对RD16 区Rv3403c 编码的Rv3403c 蛋白进行研究发现，Rv3403c 蛋白具有良好的T 抗原优势表位，该蛋白能使BALB/C 小鼠产生特异性INF-γ，且分泌量显著高于对照组，并且能诱导高水平IgG 的产生，说明其有很大潜力用来防止MTB的感染。

3 热休克蛋白

热休克蛋白（heat shock protein, HSP），是细胞在某些应激条件下表达的一类蛋白。HSP 是生物体最古老的一种分子，在各种生物体中均存在该蛋白，且高度保守，并且是一种能够被免疫系统识别的重要抗原。

目前发现HSP16.3 是MTB 潜伏期表达的主要蛋白之一，其具有抗凋亡的功能，对于MTB 的生存起调节作用。通过研究发现，在MTB 的对数生长期检测不到HSP16.3；在稳定生长期其被大量诱导表达。当MTB 进入巨噬细胞后，HSP16.3 的表达量明显增加；在敲除Rv2031c 基因后的突变株的生长情况并未受到影响，但突变株不能在巨噬细胞中生长，说明HSP16.3 蛋白并不MTB 正常生长所必须的，该蛋白的主要作用是保证MTB 在宿主免疫系统的攻击下存活。在MTB 的潜伏感染期间，Rv2031c能够诱导产生IL-10，IL-10 通过抑制T 细胞产生IFN-γ，来阻断巨噬细胞活化，使MTB 在巨噬细胞中存活。用表达HSP16.3 的DNA 疫苗免疫BALB/c小鼠，使用 MTB H37Rv攻毒后发现，与对照组相比，HSP16.3 诱导产生的IFN-γ 水平为对照组的4.8倍。目前对于MTB 的潜伏期检测尚没有良好的方法，该蛋白的发现对于明确MTB 潜伏期感染的免疫逃逸机制及其干预巨噬细胞凋亡的途径具有重要意义。

除HSP16.3 外HSP60、HSP65、HSP70 也是MTB的重要免疫学成分，HSP 系列蛋白其编码的基因用于制备DNA 疫苗，其抗MTB 感染的免疫保护力与BCG 相当，但该类蛋白在不同物种中均存在，且高度保守，用于制备亚单位疫苗可能具有一定危险性。

4 非RD 区蛋白-RV1419

目前接种BCG 是目前TB 防控的基础手段，然而BCG 属于减毒活疫苗，其接种效果受个体差异和BCG 菌株来源影响，所以目前基因重组BCG 和DNA 疫苗的研究开始受到重视。通过构建表达MTB Rv1419 抗原的DNA 疫苗（pVAX1-Rv1419）以两周为间隔三次免疫正常小鼠和TB 模型小鼠，通过流式细胞术发现实验组中小鼠血液中的CD4+T 细胞比例升高，主要发生Th1 免疫，且实验组中的肺和脾中的活菌低于对照组，肺部的病理变化明显较少，pVAX1-Rv1419 DNA 能够有效治疗TB，抑制MTB 的生长。相对于血清学检测效果明显的CFP-10、ESAT-6，Rv1419 也是目前研究较少的一种蛋白，通过生物信息学分析发现，该蛋白可能为凝集素样分子（一种能凝集红血球的糖蛋白或结合糖蛋白），凝集素的特点是其能识别糖蛋白中复杂的碳水化合物的结构，即细胞膜表面的糖基，且一种凝集素只对一种糖基专一性结合，其在固有免疫中，尤其是宿主与病原体的相互作用中起重要作用。由此说明Rv1419 蛋白应该具有较好的免疫原性。通过对Rv1419 蛋白的抗原表位预测也证实，该蛋白具有较多的T 细胞抗原表位，同时也存在着B 细胞抗原表位。利用38kDa-Rv1419 重组蛋白检测TB 感染者中抗38kDa-Rv1419 抗体发现，TB 感染组的抗体水平（22 979.1±63 846.9）明显高于非TB 组（22 987±5024.3），而在血清学检测的灵敏度上38kDa-Rv1419（63.2%）也明显高于痰涂片（16.2%）。由此可见，Rv1419 蛋白在抗MTB 感染的免疫应答中起着重要作用，其可能成为TB 血清学检测的新型候选抗原。

5 目前研究较成熟的蛋白ESAT6/CFP10

CFP-10 和ESAT-6 是目前在研究最深入的两种蛋白，分别由RD-1 区Rv3874 和Rv3875 共同转录表达，形成紧密的CFP10-ESAT6 复合物。

其中ESAT-6蛋白不仅存在于早期培养滤液中，还存在于细胞浆和细胞壁。通过PCR、Western blot、Southern 杂交等方法进行研究，表明ESAT-6 仅存在于致病性分枝杆菌中，而所有卡介苗菌株和大部分非致病性分枝杆菌的基因组都缺失该基因，不表达该蛋白，其很有可能具有分枝杆菌的特异功能。吴雪琼等用ESAT-6 纯化蛋白和PPD 作为抗原通过ELISA 检测血清抗结核抗体，结果表明，ESAT-6 蛋白的特异性高于PPD 这与Lyashchenko 等报告的结果一致。将牛分枝杆菌的毒力株和Rv3875 基因敲除突变株分别感染豚鼠后，观察其对PPD 和重组ESAT-6 蛋白的皮肤反应，结果所有豚鼠PPD 皮试均成阳性，只有牛结核杆菌毒力株接种的豚鼠重组ESAT-6 蛋白皮试阳性；推论ESAT-6 可能与分枝杆菌的致病性有关。由此，ESAT-6 具有作为致病性结核分枝杆菌诊断的抗原潜力，然而该蛋白在早期培养的滤液中含量很低，较难获得使其实用价值大大降低。

CFP-10 蛋白也被称为M.tb11 或MTSA-10，是一个早期分泌蛋白。该基因位于编码ESAT-6 基因的上游，CFP-10 也只存在于致病性分枝杆菌中而不存在于非治病分枝杆菌和卡介苗中。CFP-10 由于与麻风分枝杆菌L45 有40%的同源性，因此又名L45 抗原同源性蛋白（LHP），也是一种有效的T细胞抗原，能够引发PPD 阳性试验者的外周血单核细胞的增值反应和IFN-γ 的产生，而卡介苗接种的健康人对该抗原反应水平低。沈颖等研究发现ESAT-6/CFP-10 融合蛋白作为特异性抗原对外周单核细胞有很好的活化能力，即能刺激机体T 淋巴细胞产生特异性的细胞因子IFN-γ，此外该融合蛋白作为特异性抗原的优势在于不受卡介苗的接种干扰，避免假阳性。该融合蛋白综合了单一抗原的优势，产生的IFN-γ 具有强大的活化能力，比单一抗原更为敏感，且该融合蛋白只存在与致病性分枝杆菌中，对于牛分枝杆菌、MTB 等检测均适用，说明该蛋白具有很好的应用前景。

目前在MTB 的血清学诊断方面，很少采用单一蛋白，而是寻找免疫原性较好的多个蛋白进行组合，以期提高检测的准确率，例如QFT 试剂盒，是应用ESAT-6、CFP-10 以及TB 7.7 三种蛋白刺激血液中的T 淋巴细胞分泌IFN-γ，然后通过检测并定量分析INF-γ 的浓度来判断感染与否；PPD 是MTB的纯蛋白衍生物，通过对牛进行颈部皮内变态反应，来诊断牛是否感染MTB。有研究将牛结合菌的MPB-70 和ESAT-6 基因利用重叠延伸PCR 技术来构建表达载体，获得MPB70-ESAT6 融合蛋白，该融合蛋白与牛结核阳性血清有良好的反应性。同时发现MPB70-MPB83 复合物ELISA 检测赤鹿结核病有较好的敏感性（99.02%）和特异性（70.1%）。

综上所述，随着基因重组和蛋白纯化技术及测序技术的发展，MTB 的基因和蛋白方面的研究门槛已大大降低，而近年来，随着我国养殖业的迅速发展，TB 已经严重阻碍相关产业的发展，并威胁相关公共卫生安全，所以寻找合适的特异基因及抗原蛋白对于MTB 的诊断及防控具有重要意义。