石墨烯/细菌纤维素复合材料的原位生物合成

郭必泛，洪秋林，陈乐瑞，陈世良

(杭州师范大学钱江学院，浙江 杭州 310018)

石墨烯(GR)是由单层碳原子通过sp2杂化紧密堆砌而成的二维层状材料，具有导电性好、机械强度高等优异的性能[1-2]，在许多方面均具有潜在的应用价值. 由于GR片层之间存在强烈的π-π堆积作用[3-4]，极易发生团聚现象，这将导致其使用性能大幅下降.研究者通过Hummers法[5]将石墨烯制备成氧化石墨烯，并通过各种方法将其分散在高分子载体材料中[6-9]，有效地减少了GR分子间的团聚. 但是，这种方法制备条件苛刻、步骤繁琐，且在较大程度上破坏了GR的规整结构. 寻找实验条件温和且简单易行的GR分散技术是相关领域的研究热点之一.另一方面，载体材料的结构与性质也显著影响GR的分散性能.细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)由于具有超高比表面积、独特的三维网络和多孔结构等特点[10-11]，被广泛用作银纳米粒子、茶多酚、碳纳米管等物质的载体[12-14]，将其作为GR分散的载体，也有望获得良好的效果.

本文探究通过简单的原位生物合成技术，在无需化学处理的情况下，将GR分散到具有超高比表面积和独特3D网络结构的BC中，一步法制备得到石墨烯/细菌纤维素复合材料(GR/BC). 采用单因素法分析GR/BC产量和GR包覆率的影响因素，采用FESEM分析了GR/BC的表面形貌和GR的分散情况，采用四探针电阻率测试仪测试了GR包覆率对GR/BC复合材料电导率的影响.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

木醋杆菌，BNCC336985，北京北纳创联生物技术研究所；石墨烯(0.4—0.5 wt%)，Aladdin试剂(上海)有限公司；酵母浸膏，分析纯，生工生物股份有限公司； 葡萄糖，分析纯，生工生物股份有限公司；蛋白胨，分析纯，生工生物股份有限公司；无水乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；GR/BC膜，实验室自制.手提式压力蒸汽灭菌器，YXQ-G46-280S，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；电热恒温鼓风干燥箱，DHG-9146A，上海精宏实验设备有限公司；场发射扫描电子显微镜，Hitachi S-4200，日本 Hitachi 公司；四探针电阻率测试仪，ST2253，苏州晶格电子有限公司；超声波清洗器，KQ-250DE，昆山市超声仪器有限公司；半微量天平，EX1035A，天津市德安特传感技术有限公司；多管架自动平衡离心机，TDZ5-WS，长沙湘仪离心机仪器有限公司；紫外-可见分光光度计，SP-1900UV，上海光谱仪器有限公司；万能夹具式摇床，HY-8，常州金坛中旺仪器制造有限公司.

1.2 GR/BC的制备

配制含葡萄糖1.2 g，酵母浸膏0.15 g，蛋白胨0.15 g，乙醇300 μL，蒸馏水30mL的培养液[15-16]于100 mL的锥形瓶中，在121 ℃下高压杀菌20 min，调节溶液pH=6.5，再加入一定量的石墨烯分散液，超声分散30 min， 25 ℃恒温静置培养数天. 将复合膜取出，在浓度为0.10 mol/L的NaOH溶液中浸泡2 h，再用去离子水洗涤3次，置于50 ℃烘箱干燥至恒重，保存在样品袋中.

1.2.1 GR/BC产率的计算

将制备得到的GR/BC于50 ℃干燥至恒重，称其质量为m1(g)，培养液体积计为V( L) ，产率R1(g/L)计算方式如式(1)：

(1)

1.2.2 GR/BC中GR包覆率的计算

称取一定量已干燥的GR/BC样品，其质量计为m0(g)，置于锥形瓶中，加入一定量的硝酸溶液，60 ℃下消解反应6 h. 离心分离，将沉淀物(石墨烯)转至表面皿， 50 ℃ 下干燥至恒重，称量石墨烯的质量为m2(mg)，包覆率R2计算方式如式(2)：

(2)

1.3 材料表征

1.3.1 场发射扫描电子显微镜(FESEM)测试

剪取约1 cm×1 cm的GR/BC样品，经液氮冷冻干燥后用导电胶将GR/BC固定于样品台并进行喷金处理，设置加速电压为15 kV，观察GR/BC复合材料的形貌与GR的分布情况.

1.3.2 电导率的测定

取硅单晶电阻率标准样片进行矫正，矫正后取GR/BC样品进行测量，让样品在正反向电流的条件下各测10次，每次测量将样片转动20°～30°，共测得20个数据，取平均值.

2 结果与讨论

2.1 GR/BC复合材料的形貌结构

石墨烯分散液浓度自左向右分别为0 wt%,1.11 wt%,3.33 wt%,6.66 wt%和9.99 wt%.

图1为具有不同石墨烯含量的GR/BC复合膜光学照片，图1A为未掺入石墨烯的BC膜，其整体呈白色.随着石墨烯的加入，经原位生物合成的GR/BC复合膜颜色逐渐加深(图1B—图1E). 当石墨烯的加入量达到6.66 wt%以上时，可观察到GR/BC复合膜呈现明显的黑色，同时其颜色分布相当均匀，在宏观水平上证明了石墨烯在BC中具有良好的分散性.

石墨烯/聚合物复合材料的性能很大程度上取决于石墨烯在聚合物基体中的分散情况. 笔者通过FESEM研究了GR/BC复合材料的形貌(见图2)，细菌纤维素纳米纤维之间堆积形成了三维网络孔洞结构，GR则分散于纳米纤维的表面和纳米纤维之间的3D网络空隙内部.同时，GR在GR/BC复合材料中的分散较为均匀，从微观上进一步证实BC可作为GR理想的载体材料.另一方面，可观察到GR已形成了连续的网络结构，这对于制备具有良好导电性能的聚合物基复合材料是非常重要的.

图2 GR/BC的场发射扫描电镜图Fig.2 FESEM images of GR/BC图3 培养周期对GR/BC产量的影响Fig.3 Influence of culture period on productivity of GR/BC

2.2 制备条件对GR/BC产率的影响

图3为原位生物合成培养时间对GR/BC产率的影响，前两天为木醋杆菌的生长期，此时培养液中几乎没有观察到膜的形成. 从第三天开始，木醋杆菌开始快速生产细菌纤维素，同时，石墨烯也被包裹入细菌纤维素三维网络中并形成GR/BC复合膜(产膜期). 随着培养时间的延长，GR/BC复合膜的产量也逐渐增加，培养5d后GR/BC的产量达到2.4 g/L. 进一步延长培养时间则不会导致复合膜产量的提高. 这是由于在培养过程中有酸酮类物质形成[17]，导致培养液的pH值降低，不利于木醋杆菌的生长；另一方面，培养基中的营养物质被不断消耗，也阻碍了木醋杆菌合成细菌纤维素，导致GR/BC复合膜的产量基本不再变化. 因此，确定GR/BC复合膜的最佳培养时间为5 d.

图4为GR/BC形成过程的光学照片. 如前文所述，前两天为木醋杆菌的生长期[17]，此时较难在培养液中观察到细菌纤维素膜的形成(图4A).第三天后，丝状的细菌纤维素纳米纤维初步形成，将部分GR包裹固定并形成类膜状结构(图4B)，该结构较为疏松，轻微振动便可使之破坏.随着培养时间的延长，完整、稳定的GR/BC复合膜逐渐形成，培养液也逐渐变得清晰(图4C，图4D).

培养时间自左至右分别为2，3，4，5d

图5为培养液pH值随培养时间变化趋势，当木醋杆菌处于生长期时，培养液的pH值随着培养时间的增加而下降；而当木醋杆菌开始生产细菌纤维素时，在一段时间内溶液的pH值基本保持不变，这段时期是GR/BC复合膜生产速率最快的一段时期(产膜期). 当培养时间达到约100 h时，培养液的pH值又开始下降，此时GR/BC复合膜的生产速率也快速降低，GR/BC膜的产量基本不再增加，说明此时的pH值已经不利于木醋杆菌的生产，这与图3的实验结果一致.

图5 培养液pH值随时间的变化Fig.5 Influence of culture time on the pH value of the solution图6 培养液中石墨烯浓度对GR/BC复合膜产率的影响Fig.6 Influence of initial graphene concentration of productivity of GR/BC

图6为石墨烯初始浓度对GR/BC复合膜产率的影响.在较低浓度时，随着石墨烯浓度的增加，GR/BC复合膜的产率基本保持不变. 当石墨烯浓度达到10 wt%以上时，进一步提高石墨烯浓度将导致GR/BC产率明显下降.由于石墨烯片层之间存在较强的相互作用[18-19]，具有发生分子间团聚的倾向，这种趋势随着浓度的增加而升高，这不利于细菌纤维素的包覆；另一方面，高浓度时石墨烯可能大量覆盖在木醋杆菌表面，阻碍其与营养物质的接触，导致部分木醋杆菌无法正常合成细菌纤维素，从而导致GR/BC复合膜产率大幅下降. 当石墨烯浓度达到10 wt%以上时，这种现象开始变得明显，严重影响GR/BC复合膜产量. 而当石墨烯添加量达到16.65 wt%以上时， GR/BC复合膜无法正常形成.

2.3 石墨烯包覆率对GR/BC电导率的影响

图7是石墨烯初始浓度对GR/BC复合膜中GR包覆率的影响. 从图7中可以看出，随着GR浓度的增加，GR包覆率逐渐上升. 进一步增加GR浓度，将使GR包覆率显著下降.如前文所述，当GR加入量达到一定值后，GR的团聚作用明显加剧，此时GR难以被均匀掺入BC中；同时，高浓度的GR将使木醋杆菌难以接触营养物质而导致无法正常生产BC. 本文选择最佳的GR浓度为10 wt%，此时所得的GR/BC复合膜中GR包覆率可达30 mg/g以上.

图7 石墨烯浓度对GR/BC中GR包覆率的影响Fig.7 Influence of graphene concentration ongraphene contentof GR/BC图8 GR包覆率对GR/BC电导率的影响Fig.8 Effect of graphene content on electrical conductivity of GR/BC

图8是GR包覆率对GR/BC电导率的影响.纯BC不导电(数据未显示)，而GR的引入使得GR/BC复合膜具有一定的导电性，且GR含量对GR/BC电导率有显著的影响. 从图8中可看出GR/BC复合膜的电导率随着GR的加入而增大，当GR包覆率达到15 mg/g以上时，GR/BC的电导率迅速增加，这是由于此时复合膜中的GR已开始形成连续网络结构(如图2)，当包覆率达到25 mg/g时，GR/BC复合膜的电导率高达约43 S/m.进一步增加GR包覆率，GR/BC的电导率稍稍增大，包覆率为30 mg/g复合膜的电导率约为50 S/m，这可能是由于GR/BC复合膜中已形成完整的导电网络时，继续增加GR含量并不能使复合膜的电导率发生明显的变化.

3 结论

将石墨烯分散液加入到含有葡萄糖、酵母浸膏、蛋白胨和乙醇的培养液中，采用原位生物合成技术、经木醋杆菌发酵培养后制备得到石墨烯掺杂细菌纤维素复合膜(GR/BC). 当培养液中石墨烯分散液的浓度为10 wt%时，经过5 d培养后，GR/BC复合膜的产率达到2.4 g/L，复合膜中GR包覆率约为30 mg/g. GR/BC复合膜的电导率随着石墨烯包覆率的增加而增大，含30 mg/g 石墨烯的GR/BC复合膜的电导率高达50 S/m.GR相互连接形成的连续导电网络是GR/BC复合膜具有高电导率的主要原因.