一种双响应范围pH荧光探针的合成与性能

刘 甜， 罗茜煜， 黄子杰， 郑祯凯， 区芷褀， 马立军

(华南师范大学化学学院， 广州 510006)

pH在化学反应、环境监测以及生物系统等领域扮演着十分重要的角色[1-3]，pH的异常将引发一系列不良反应，如导致化学反应失败、环境污染以及生物体病变等. 因此，在这些领域中对pH的准确测定具有非常重要的意义[4]. 传统的pH检测方法主要有指示剂法[5]、电位滴定法[6]、微电极法[7]、吸收光谱法以及电化学法等[8-9]，而荧光探针具有高选择性、高灵敏度、高信噪比、操作简单、响应快速、可连续监控等优点[10-11]，因此受到越来越多的关注.

迄今为止，许多优异的pH荧光探针已被报道，其中一些探针已经在分析化学、生理学和生物学中得到了广泛应用. 然而，大部分探针只能检测单一酸性[12-13]或碱性[14-15]范围的pH，在实际应用中相对受限，只有很少一部分能够在酸性和碱性2个范围内对pH进行检测[16]. 因此，有必要设计能够覆盖较大pH范围的荧光探针.

芘类化合物具有吸收系数大、单重态寿命长、荧光量子产率高、化学稳定性好等优良的光学性质，因此常被用作荧光团[17]. 目前已报道的少量基于芘的pH荧光探针[18-19]同样存在检测范围有限的问题. 本文以芘甲醛作为荧光发色基团，与水合肼进行简单的席夫碱反应，再与3,4-二羟基苯甲醛相结合，所得荧光探针分子4-((Z)-((E)-(芘-1-基亚甲基)亚肼基)甲基)苯-1,2-二醇(POH)上的亚氨基可以作为H+的识别基团，酚羟基作为OH-的识别基团，可同时检测酸性和碱性溶液的pH.

1 实验部分

1.1 实验仪器和试剂

仪器：荧光分光光度计(F-4600 FL，日本日立)、紫外-可见分光光谱仪(UV-2700,日本岛津)、核磁共振波谱仪(NMR Systems 600 MHz,美国瓦里安)；液相色谱-质谱联用仪(LCQ Deca XP MAX,美国赛默飞世尔)、pH计(PHS-3C,上海精密雷磁).

试剂：1-芘甲醛、3,4-二羟基苯甲醛、水合肼(体积分数为80%)、冰醋酸、无水乙醇、二甲基亚砜(DMSO)、柠檬酸(CA)、Na2HPO4、NaH2PO4、NaOH、盐酸等均为分析纯，配制溶液用水为去离子水.

1.2 POH探针的合成与表征

POH探针的合成路线[20]如图1所示,POH探针的合成主要分2步：芘亚甲基联氨(1)的合成、POH(2)的合成.

图1 POH的合成路线

将1-芘甲醛(0.234 5 g，1.00 mmol)溶于20 mL无水乙醇后加入水合肼(0.150 0 g，3.00 mmol)，滴加5滴冰醋酸作为催化剂，混合物在室温下搅拌反应约4 h得黄色沉淀，然后用真空泵抽滤，滤饼经过冰乙醇洗涤3次，最后将滤饼置于真空干燥箱中烘干得到0.182 1 g芘亚甲基联氨(1)黄色粉末，产率74.5%.

称取0.182 1 g产物1(0.745 mmol)溶于20.0 mL无水乙醇，加入3,4-二羟基苯甲醛(0.102 9 g，0.745 mmol)，再加5滴冰醋酸作为催化剂，混合物在室温下搅拌反应约15 h得到橙黄色沉淀，采用真空泵抽滤，冰乙醇洗涤3次，最后置于真空干燥箱烘干得到0.206 0 g POH(2)橙黄色粉末，产率为75.9%.

化合物POH的1H NMR谱(600 MHz，DMSO)中化学位移分别为：δ9.70 (s,1H), 9.66 (s,1H), 9.38 (s,1H), 9.15 (d,J=9.3 Hz,1H),8.75～8.68 (m, 2H),8.42～8.35 (m,4H),8.32 (d,J=8.9 Hz,1H),8.26 (d,J=8.9 Hz,1H),8.15 (t,J=7.6 Hz,1H),7.46 (d,J=1.8 Hz,1H),7.24 (dd,J=8.1,1.8 Hz,1H),6.89 (d,J=8.0 Hz,1H). ESI-MS(甲醇作溶剂)：分子式为C24H16N2O2，相对分子质量理论值、实验值分别为364.12、365.89.

1.3 测试溶液的配制

将POH溶于DMSO中配成浓度为5.0 mmol/L的母液，用CA、Na2HPO4、NaH2PO4分别与去离子水配制成不同pH的缓冲溶液(0.2 mol/L)，并用浓度均为1.0 mol/L的盐酸和NaOH溶液对pH进行微调. 取12.0 μL POH母液加入到容积为3.0 mL的离心管中，配制成POH浓度为20.0 μmol/L的含DMSO(体积分数30%)且具有不同pH的缓冲溶液，进行后续的光谱测试.

2 结果与讨论

2.1 探针POH对H+和OH-响应的紫外-可见吸收光谱

为了更直观地观察探针对pH的响应现象，对酸性和碱性2个pH范围内的溶液紫外-可见吸收光谱分别作图(图2). 由于N原子的质子化，POH的谱图在pH小于6.00时出现2个吸收峰(图2A)，波长分别为285、310 nm，归因于芘环内部的π-π*跃迁. 当pH从2.00增加到6.43时，在波长为285、310 nm处的吸收峰强度不断减弱; 当pH为6.43时，由于N原子的质子化作用减弱，孤对电子得到释放导致芘环内部的π-π*逐渐消失，n-π*跃迁慢慢增强，在波长约400 nm处开始出现1个新的吸收峰. 当pH持续增加时，该处的吸收峰强度增大且伴随着红移现象，导致溶液的颜色由无色变为浅黄色. 在pH由7.00增加到11.12的过程中(图2B)，紫外吸收峰持续红移，与此同时溶液的颜色由浅黄色变为橙黄色. 产生这些变化的原因可能是碱性条件下POH分子上的酚羟基发生去质子化作用，导致推电子能力增强，电子流动性变大使得苯环上电子云密度发生改变，增强了从苯环到N原子上的分子内电荷转移(ICT)作用，从而导致吸收光谱发生明显红移，并且伴随溶液颜色的改变.

图2 不同pH下POH的紫外-可见吸收光谱和颜色变化

Figure 2 The UV-Vis spectra and color transformation of POH at different pH

2.2 探针POH对H+和OH-响应的荧光识别

在酸性条件下，测试激发波长为350 nm时的荧光发射光谱(图3A)，POH的缓冲溶液在波长465 nm处有较强的荧光发射峰，且在紫外灯照射下溶液呈现蓝色荧光. 随着pH的不断增大，POH的荧光强度逐渐减弱，在pH=7.00时荧光强度几近猝灭. 产生这种变化的原因是酸性条件下由于N原子的质子化作用，抑制了POH分子内N原子对芘环的光致电子转移(PET)效应，从而使酸性条件下芘环的荧光得以恢复; 中性条件下N原子未被质子化，因此自由电子转入激发态荧光团，使荧光猝灭. 当pH继续增至9.00时(图3B)，POH缓冲溶液在波长465 nm处荧光峰的强度又开始逐渐增强，紫外灯下溶液的荧光变为亮蓝色. 这种变化归因于碱性条件下POH分子中苯环上的酚羟基发生去质子化作用，推电子能力增强，电子流动性变大使苯环上电子云密度发生改变从而增强了从苯环到N原子上的ICT作用，同时阻止了N原子对芘环的PET作用而使荧光强度开始增加(图4).

图3 不同pH下POH的荧光光谱

图4 POH探针的酸碱响应过程

根据方程[21]

pKa=pH+lg[(Fmax-F)/(F-Fmin)]

可以计算出2个范围内POH的pKa，pH在1.85～7.62酸性范围时pKa=4.69(图5A)，pH在7.51～11.12碱性范围内POH的pKa=10.40(图5B)，说明POH在酸性和碱性2种条件下都能很好地检测溶液的pH[22]，是一种检测范围很宽且灵敏度高的pH荧光探针.

图5 POH的荧光发射峰强度与pH的关系

Figure 5 The intensity of the fluorescence emission peak of POH at different pH

2.3 探针POH的抗干扰性

为了研究探针POH的实用性，对其进行干扰性实验检测. 在pH为2.34和10.21的POH缓冲溶液中分别加入10倍浓度的常见金属离子，并测试其荧光发射光谱(图6). 在酸性溶液中，金属离子的加入对POH溶液的荧光峰强度影响不大(图6A)；而在碱性溶液中，除了Hg2+、Mn2+和Co2+等少数金属离子干扰较大外，其余金属离子对pH的检测几乎无影响. 总体上，POH是一种具有实际应用潜力的高选择性pH荧光探针.

图6 不同pH下POH溶液的抗干扰性检测

3 结论

采用芘甲醛与3，4-二羟基苯甲醛通过与水合肼之间的席夫碱反应合成了一种高灵敏性、高选择性的pH荧光探针POH，并表征了它的结构. 通过对紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱的测试，发现探针POH在酸性和碱性条件下对缓冲溶液的pH均表现出比色和荧光的双重识别响应，并且溶液颜色有明显的转变. 同时在不同pH下与其他常见金属离子共存时对pH检测的干扰影响不大，是一种可以检测很宽范围pH的高潜力应用型荧光探针.