石榴花挥发油的GC-MS分析及β-葡萄糖苷酶对石榴花的增香作用研究

刘铮铮,刘语,宋宁,杨广德

(西安交通大学药学院，西安 710061)

石榴花为石榴科植物石榴(PunicagranatumL.)的花，含有多酚类、黄酮类、萜类等活性成分[1]。石榴花性平、涩，可用于治疗中耳炎、鼻衄、创伤出血、口臭、腋臭等；在维吾尔族医学中素以“古丽娜”之称而入药，用于退翳，治神经衰弱和恶心[2]；石榴花具有降糖作用，国内外常用石榴花治疗糖尿病及其并发症[3-5]；石榴花提取物还具有抗氧化作用，能清除多种自由基和保护脂蛋白[6]。

早在1993年Angelika等[7]发现鞣花酸能明显抑制化学物质诱导的癌变及其他多种癌变，尤其对结肠癌、食管癌、肝癌、肺癌、舌及皮肤肿瘤等抑制作用更明显。Wang等[8]从石榴花乙醇提取物中分离到一种新多酚类物质，命名为石榴酸，该物质有抗炎和抗氧化等药理作用，自然界中分布较广。

王超萍[9]利用紫外分光光度法测定石榴花中总黄酮类的含量。杨彦霞等[10]从石榴花中分离出12黄酮类个化合物。郭俊明等[11]对云南石榴花色素进行研究，结果表明石榴花的色素为黄酮类成分。Zhang等[12]在石榴花中鉴定出了2种花青苷成分。

石榴花中含有少量的挥发油成分，陈志伟等[13]提取了石榴花中的挥发油，鉴定出石榴花中的挥发油成分，发现其主要成分为醛类和脂肪酸，还含有月桂烯、红没药烯、法呢醇3种萜类化合物和二十一烷、二十四烷、二十五烷等5种烷烃类化合物。石榴花挥发油的体外抗氧化活性很好，可用于开发抗氧化保健品、药品和天然保健抗氧化剂。

糖苷键合态香气前体物质(glycosidically boundaroma precursors)是以糖苷的形式存在于植物中的香气前体物质，不具有挥发性，稳定性强；在酸或酶的作用下可以释放出游离态芳香物质[14]。β-葡萄糖苷酶又称β-D-葡萄糖苷水解酶，它属于纤维素酶类。是一种广泛存在于生物界的能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶，它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。植物中以苷形式存在的非挥发性前体物质可以通过酶解作用使得香气成分得以释放表现出显著的增香作用[15-16]。不仅如此，β-葡萄糖苷酶还能将果蔬及茶叶中的风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质[17-18]。

本实验采用GC-MS分析石榴花挥发油化学成分，同时利用β-葡萄糖苷酶水解石榴花，以验证β-葡萄糖苷酶对其是否具有增香作用，为石榴花资源的开发利用提供科学依据。

1 实验材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料：石榴花采于2018年7月采自西安交通大学药学院的药园，由西安交通大学药学院牛晓峰教授鉴定为石榴科植物石榴(PunicagranatumL.)的花。

试剂：β-葡萄糖苷酶(上海源叶生物科技有限公司，100 U/g)；正己烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色谱纯)；无水硫酸钠(西安化学试剂厂，分析纯)；磷酸氢二钠(河南焦作市化工三厂)；柠檬酸(成都化学试剂厂)。

仪器：GCMS-TQ8040型气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司)；AY120电子天平(日本岛津公司)；挥发油提取器(无锡久平仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 β-葡萄糖苷酶水解反应。分别称取2份200 g新鲜石榴花于500 mL pH 5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中，其中1份加0.2 g β-葡萄糖苷酶，同时置于摇床中50 °C恒温水浴5 h。同法制备空白溶液。

1.2.2 挥发油的提取。将200 g β-葡萄糖苷酶水解前后的石榴花分别置于2000 mL圆底烧瓶中，加水800 mL，沸石数粒，摇匀，按2015年版《中国药典》四部通则2204(挥发油测定法，甲法)提取挥发油，保持微沸4 h。读取挥发油体积并收集所得挥发油，加入少量无水硫酸钠，静置。然后，称取石榴花挥发油0.1 g置于5 mL量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，待测。

1.2.3 气相色谱-质谱联用的色谱条件。色谱条件：SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气：He(≥99.99 %)；流速：1 mL/min；进样口温度：250 ℃；分流比：5∶1；升温程序：色谱柱始60 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升温至150 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升温至200 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升温至280 ℃，保持1 min；质谱：接口温度为250 ℃，离子源温度：230 ℃，电子轰击源EI，电子能量：70 eV，质量扫描范围：45～550 m/z；进样量：1 μL；溶剂峰切除时间为2.5 min，质谱检测起始时间为3 min。

1.2.4 数据处理。所得的色谱和质谱信息经数据处理系统与其内存谱库(NIST)自动检索和解析，并用峰面积归一法测定了各化学成分在挥发油中的相对百分含量。

2 结果

采用气相色谱-质谱联用方法对β-葡萄糖苷酶处理前后的石榴花的挥发油提取物进行分析，鉴定出无酶石榴花和有酶石榴花挥发油各42种化合物。其总离子流图结果如下：

图1 无酶石榴花挥发油的GC-MS总离子流图

图1 有酶石榴花挥发油的GC-MS总离子流图

通过分析比较，确定色谱条件筛选后的GC-MS方法对色谱峰可以达到较好的分离。通过计算机谱库检索及核对质谱图，β-葡萄糖苷酶水解前后的石榴花挥发油提取物的化学成分分析见表1。

表1 石榴花挥发油化学成分分析表

续表1

保留时间/min化合物中文名称分子式相对峰面积(%)无酶石榴花有酶石榴花31.539丁香酚C10H12O29.913.1234.230顺式-茉莉酮C11H16O4.073.4136.074β-石竹烯C15H242.031.4837.241反式-α-香柑油烯C15H241.140.7538.684β-金合欢烯C15H240.500.2139.3402,6,10-三甲基十三烷C16H342.112.6341.743α-金合欢烯C15H247.837.9842.656β-倍半水芹烯C15H240.490.4546.962正十六烷C16H341.6514.9152.130正十七烷C17H362.527.1154.966菲C14H101.2810.0056.548正二十一烷C21H442.8715.56

β-葡萄糖苷酶处理前后石榴花挥发油成分分析：本次实验从无酶石榴花的挥发油提取物中确证了42个化合物，从有酶石榴花的挥发油提取物中确证了42个化合物，观察到加入β-葡萄糖苷酶前后的石榴花挥发油的成分并无变化。

由表1可知，在无酶石榴花挥发油中的含有许多醛酮类、烯烃类和醇类物质，其主要成分为苯乙醛(12.63%)、水杨酸甲酯(10.19%)、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚(10.46%)、丁香酚(9.91%)、α-金合欢烯(7.83%)、糠醛(5.93%)等。在有酶石榴花挥发油中也含有醛酮类、烯烃类和醇类物质，其主要成分为正二十一烷(15.56 %)、正十六烷(14.91%)、菲(10.00%)、α-金合欢烯(7.98 %)、水杨酸甲酯(7.22 %)、正十七烷(7.11 %)等。

通过表1的对比，可知在石榴花中β-葡萄糖苷酶存在作用。对比可知在加入β-葡萄糖苷酶后L-柠檬烯、2,6,10-三甲基十三烷、α-金合欢烯、正十六烷、正十七烷、菲、正二十一烷的相对含量分别增加0.15%、0.52%、0.15%、13.26%、4.59%、8.72%、12.69%，增长率达到55.56%、24.64%、1.92%、803.63%、182.14%、681.25%、442.16%。同时可以观察到糠醛、苯乙醛、水杨酸甲酯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、丁香酚等其余物质的相对含量均出现明显降低。

近年来，在风味科学领域内很重视研究风味物质的前二级代谢产物，如糖苷类物质。这些物质本身无香味，不挥发，但若用酶水解，即可产生浓郁的具有天然特征风味的物质[19]。天然芳香植物中糖苷化合物的研究，一直是香料化学家们感兴趣的研究课题之一，并将这类物质纳入“香味前驱体”(flavor precursors)[20]。一些植物由于含有很多的香精类因而表现出香味，不同的香精成分能够表现出不同的气味。石榴花中的许多成分可以用作香料，比如糠醛是GB 2760-96允许使用的食品用香料也是萃取溶剂，主要用于配制各种热加工型香精，如面包、奶油硬糖、咖啡等香精；L-柠檬烯为无色液体，有似鲜花的清淡香气，溶于乙醇和大多数非挥发性油，不溶于水，天然品存在于椒样薄荷油、留兰香油、松针油、桉叶油等中。苯乙醛主要用于风信子、水仙、黄水仙、甜豆花等配方中，少量用于其他花香型中，赋予青的头香，有提调香气的作用；癸醛用于有机合成和作香料用，常用作鸢尾、橙花、素馨、香叶、香堇、玫瑰等香精的调配原料，在制造人工香柠檬油、橙花油、玫瑰油时也少量使用。香叶醇GB2760-96规定为允许使用的食用香料，主要用以配制苹果、桃、杏、李、草莓、柠檬、姜、肉桂、肉豆蔻和蜂蜜等香精。

加入β-葡萄糖苷酶后石榴花的香精类成分含量除L-柠檬烯皆有所下降，非香精类成分2,6,10-三甲基十三烷、正十六烷、正十七烷、菲、正二十一烷的含量有所上升，表明β-葡萄糖苷酶对石榴花的增香作用不明显。

3 结论

实验测定得到石榴花挥发油中42种化合物，测定了β-葡萄糖苷酶水解前后石榴花挥发油的化学成分主要以醛酮类化合物为主，为进一步开发和利用石榴花资源提供了理论依据。而β-葡萄糖苷酶则抑制了石榴花中一些香精类成分的释放，这证明了β-葡萄糖苷酶的加入，致使一些香精类成分含量有所减少，其只能增加石榴花中的某些特定成分，如L-柠檬烯，而不能使全部香精成分的相对含量增加，故其对石榴花的增香作用并不明显。