SB431542对人羊膜上皮细胞上皮间质转化的影响

王静，戴成祥，李萍，沈美萍，李苏克，刘必佐

·论著·

SB431542对人羊膜上皮细胞上皮间质转化的影响

王静*，戴成祥*，李萍，沈美萍，李苏克，刘必佐

201210 上海赛比曼生物科技有限公司

探讨通过添加 TGF-β 抑制剂 SB431542控制人羊膜上皮细胞的干性、表型和间质特性，为SB431542 在预防人羊膜上皮细胞上皮间质转化（EMT）中的作用提供依据。

使用不同浓度 SB431542 培养 P2 代人羊膜上皮细胞，通过细胞的增殖曲线和基因水平（CK8、ACTA2、OCT4 和 KLF4）表达的差异，筛选出最适浓度。以不加 SB431542 的细胞为对照组，以加最适浓度的 SB431542 为实验组，比较不同代次的对照组和实验组的细胞倍增时间，基因表达水平（CK8、CK19、OCT4、KLF4、Vimentin、ACTA2），流式检测细胞表面标志物（CD146、CD105、SSEA4）和免疫荧光检测细胞蛋白表达情况（CK8、ACTA2、EpCAM）的差异。

使用不同浓度 SB431542 培养 P2 代人羊膜上皮细胞，5 μmol/L SB431542 培养条件下的细胞增殖曲线最优，且基因水平（CK8、ACTA2、OCT4 和 KLF4）表达最优，最终筛选最适药物浓度为 5 μmol/L SB431542 完成后续实验。在 5 μmol/L SB431542 培养条件下，P7 代实验组的细胞倍增时间优于对照组；P7 代实验组细胞的 CK8、CK19、KLF4、OCT4 的表达水平明显高于对照组细胞的表达水平，实验组的 ACTA2（α-SMA）和 Vimentin 表达水平明显低于对照组细胞的表达水平；P3 和 P5 代细胞的实验组的间充质标志物 CD146、CD105 的表达量均比对照组的低，实验组干细胞标志物 SSEA4 的表达量均比对照组的高；P7 代实验组的 CK8 和 EpCAM 表达效果强于 P7 代对照组细胞，且 P7 代实验组的 α-SMA 基本不表达。

5 μmol/L SB431542 在人羊膜上皮细胞体外培养7 个代次以内可以有效地抑制其上皮间质转化的发生。

人羊膜上皮细胞； TGF-β； SB431542； 上皮间质转化； 干细胞

羊膜是位于胎儿胎盘内侧的一层薄膜。人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）表达多种胚胎干细胞表面标志物：肿瘤排斥抗原 TRA1-60、TRA1-81，阶段性特异性抗原 SSEA3、SSEA4，多潜能转录因子 NANOG、OCT4、SOX2[1]。这些因子相互协调，在维持胚胎干细胞的自我更新和多向分化潜能方面发挥着关键作用[2]。目前，人羊膜上皮细胞已在结膜重建、神经系统疾病、肝脏疾病等动物疾病模型中取得初步成效[3-6]。然而，要实现人羊膜上皮细胞的临床应用，仍有许多待解决的问题，特别是上皮间质转化的发生。人羊膜上皮细胞在体外扩增过程中由于自发经历了上皮间质转化（EMT），其自身会发生性状的改变[7]。EMT是上皮细胞获得间充质表型的一个转分化过程。上皮细胞通常呈顶基极性，通过黏附连接和紧密连接表现出较强的细胞-细胞黏附性，基底基质主要由 IV 型胶原和层粘连蛋白组成[8]。EMT 诱导发生后，上皮细胞失去黏附性，细胞形态发生改变，并获得了顶端到尾端的极性[8-9]。发生 EMT 的上皮细胞分裂并侵入基底膜，沿着纤维连接蛋白和 I 型胶原新形成的基质迁移[9]。上皮细胞标志物的丰度开始降低，而间质标志物的丰度开始增加。细胞通路信号，如 TGF-β、Wnt 和 FGF 可以抑制 EMT 以及促进它的逆向过程 MET 的发生[10]。EMT 过程将会导致上皮细胞相关蛋白（E-Cadherin、Cytokeratin-8）表达的丢失，上调间充质相关蛋白[如波形蛋白（Vimentin）、α 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）]的表达[10-11]，特别是 EMT 显著改变了人羊膜上皮细胞的生物学特性和再生潜力[12-13]。人羊膜上皮细胞 EMT 是一种依赖于 TGF-β 的现象，使用一种 TGF-β 受体抑制剂 SB431542 可以阻止 EMT的发生并保留人羊膜上皮细胞的上皮表型。SB431542 是一种 TGF-β I 型受体激活素受体样激酶（ALK）5、ALK 4 和 ALK 7 的抑制剂，可以诱导 Smad2/Smad4 和 Smad3/Smad4 依赖的转录，但对 BMP 信号通路没有影响[14]。在 A498 细胞中，SB431542 抑制TGF-β I 诱导的胶原 Iα1 和 PAI-1 mRNA。此外，SB431542 抑制 TGF-β I 诱导的纤连蛋白 mRNA 和蛋白的表达[15]。SB431542 抑制 TGF-β 调节的生长因子，包括 PDGF-A、FGF-2 和 HB-EGF[16]。在 NMuMG 和 PANC-1 细胞中，SB431542 也抑制 TGF-β 调节的上皮细胞向间质转型[17]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与耗材 人足月胎盘经知情同意情况下获得，符合伦理要求。上皮细胞培养基（EpiCM）购于美国 Sciencell 公司；10 × TrypLE、RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit、TaqMan®Gene Expression assays、α-SMA 多克隆抗体、CK8 单克隆抗体均购于美国 Thermos 公司；SB431542 购于美国 Selleck 公司；RNAeasy™ Plus 动物 RNA 抽提试剂盒（离心柱式）、CCK8 均购于上海碧云天生物技术有限公司；CD146-PE、CD324-FITC、SSEA4-FITC、CD105-APC 均购于美国 Biolegend 公司；DMSO 购于德国 WAK 公司；青链霉素购于德国 PAN Biotech 公司。

1.2 方法

1.2.1 人羊膜上皮细胞的分离 将胎盘的胎儿面朝上放置于紫外消毒生物安全柜，使用手术刀划“十”字，四等分羊膜，使用无菌手术镊、手术剪剥取胎盘表面的羊膜。第一次消化：①将羊膜置于 10 cm 直径培养皿，培养皿中装有 1/2 体积的含有抗生素（1% 青链霉素）的PBS。②用手术镊夹持羊膜进行漂洗，重复漂洗 2 ~ 3 遍，去除血细胞。③转移羊膜至新的 10 cm 直径培养皿中，添加 10 × TrypLE（10 ml/g 组织），将组织放置于恒温摇床中，37 ℃，100 r/min 消化0.5 h。④消化完毕，将组织及消化液转入 15 cm 直径的培养皿中，使用细胞刮铲，轻刮细胞。⑤将羊膜组织转入新的 10 cm 直径培养皿中，用于第二次消化。细胞悬液转入50 ml 离心管中，以 4 ℃、300 ×条件离心10 min。⑥弃去上清液，使用 20 ml PBS 重悬沉淀，4 ℃保存。第二次消化：①在 10 cm 直径培养皿的羊膜组织中，添加 10 × TrypLE 20 ml，将组织放置于恒温摇床中，37 ℃、100 r/min 消化0.5 h。②消化完毕，将组织及消化液转入 15 cm 直径的培养皿中，使用细胞刮铲，轻刮细胞。③细胞悬液转入 50 ml 离心管中，以 4 ℃、300 ×条件离心10 min。④弃去上清液，使用 20 ml PBS 重悬沉淀，4 ℃保存。⑤将第一次和第二次消化的细胞悬液混匀，台盼蓝计数，按照 2 × 104/cm2接种 T75 培养瓶，37 ℃体积分数 5% CO2培养。⑥ 48 h 换液，以后每 2 天换液 1 次，直至细胞可以进行传代。

1.2.2 人羊膜上皮细胞的原代培养 细胞接种密度为 2 × 104/cm2，37 ℃体积分数 5% CO2培养。使用未添加 SB431542 的上皮完全培养基进行培养。上皮完全培养基的配制按照EpiCM 的使用说明进行。人羊膜上皮细胞的传代培养：人羊膜上皮细胞生长至 90% 时，每个 T75 培养瓶加入 2 ml TrypLE 进行消化传代。消化 2 min，加未加药物的上皮完全培养基终止消化，将细胞悬液转移至50 ml 离心管中，1200 r/min 离心 5 min，弃上清，计数，按照 1 × 104/cm2接种，置于 37 ℃体积分数 5% CO2培养。传代培养基：上皮完全培养基中添加不同浓度的 SB431542。

1.2.3 筛选最适浓度 SB431542 ①将 SB431542 溶于 DMSO，浓度配制成 10 mmol/L。②将 10 mmol/L SB431542 加入至上皮细胞完全培养基中，分别配制成 0、1、5、10、50 μmol/L 浓度。③取 P2 代人羊膜上皮细胞，使用不同药物浓度的培养基进行培养，每 2 天换一次加药培养基。④使用 CCK8，对培养 1、2、3、4 d 的 P2 代细胞进行生长曲线测定。⑤使用 qPCR 检测培养 3 d 的 P2 代细胞的 CDH1、CK8、OCT4、KLF4、ACTA2（α-SMA）的基因表达情况。⑥筛选出最适的药物浓度完成后续实验。

1.2.4 细胞生长曲线测定 取不添加 SB431542 的上皮完全培养基培养的 P1 代人羊膜上皮细胞，经 TrypLE 消化，以 1 × 104/cm2的密度接种于96 孔板，每个药物浓度的细胞接种 2 孔。以对应的药物浓度的完全培养基作为空白对照，接种2 孔，SB431542 的浓度分别为 0、1、5、10、50 μmol/L。使用 CCK8 试剂盒测试在不同浓度 SB431542 的培养条件下，人羊膜上皮细胞在 1、2、3、4 d 的代谢值，并筛选出细胞代谢最高值对应的药物浓度。

1.2.5 细胞倍增时间测定 取不添加 SB431542 的上皮完全培养基培养的 P1 代人羊膜上皮细胞，经 TrypLE 消化，以 1 × 104/cm2的密度接种于T25 培养瓶。对照组细胞使用不加 SB431542 的上皮完全培养基，实验组细胞使用最适浓度的 SB421542 的上皮完全培养基进行培养，等细胞90% 融合度，进行传代，标记为 P2 代细胞，以此类推，计算出 P1 ~ P7 代每个代次的人羊膜上皮细胞的倍增时间。细胞倍增时间计算：DT = t×[lg2/（lgNt – lgN0）]（t：培养时间；N0 为接种细胞数，Nt 为 t 时间后的细胞数）。

1.2.6 荧光定量 PCR（qPCR）检测 使用 RNA 抽提试剂盒抽提 RNA，使用 RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit 反转录 1 μg RNA。根据实验要求，使用 TaqMan®Gene Expression assays 中的探针为引物（表 1），荧光定量 PCR 检测相关转录因子 mRNA 表达量。并以 GAPDH 为内参，实验重复 3 次。PCR 结束后收集 Ct 值，使用 2-∆∆CT法对实验数据进行分析。

表 1 荧光定量 PCR 引物设计

注：使用TaqMan Gene Expression assays进行 qPCR 分析，评估相关转录因子的 mRNA 表达水平情况。

Note: TaqMan Gene Expression assays were used for qPCR analysis to evaluate mRNA expression levels of related transcription factors.

1.2.7 免疫荧光鉴定羊膜上皮细胞 ①取出12 孔板，将涂有多聚赖氨酸的细胞爬片置于孔内；②以不加药物培养的 P1、P3、P7 人羊膜上皮细胞作为阴性对照，以最适浓度 SB431542 培养的 P1、P3、P7 人羊膜上皮细胞作为实验组，以 1 × 104/cm2密度接种；③细胞爬片按以下步骤进行染色：PBS 漂洗 3 次，细胞经 4% 多聚甲醛溶液室温固定20 min；PBS 漂洗 3 次，使用 0.5% Triton X-100 进行破膜；加入 500 μl 封闭液（PBS 含0.1% 的BSA 稀释）室温封闭30 min；分别加入一抗 CK8、EpCAM、α-SMA 在 4 ℃条件下孵育过夜；PBS 漂洗 3 次，加入二抗，室温避光孵育 1 h；PBS 漂洗 3 次，加入1 µg/ml 的DAPI 500 μl，孵育10 min。漂洗、晾干、封固后荧光显微镜下观察。

1.2.8 流式检测人羊膜上皮细胞 ①以不加药物培养的 P3、P5、P7 人羊膜上皮细胞作为阴性对照，以最适浓度 SB431542 培养的 P3、P5、P7 人羊膜上皮细胞作为实验组。收集细胞悬液，1500 r/min 离心 5 min，弃上清（留 100 μl 左右液体）。②加抗体（CD324、CD146、CD105、SSEA4），避光 20 min孵育。③加 1 ml/管 PBS，1500 r/min 离心 5 min，弃上清。④加 500 μl PBS，样品用于上机。

1.3 统计学处理

使用 GraphPad Prism 5.0 对数据进行分析。

2 结果

2.1 5 μmol/L SB431542 为最适药物浓度

使用 CCK8 检测 P2 代人羊膜上皮细胞在不同浓度药物影响下每天的代谢450值。从实验数据来看（图 1A），50 μmol/L SB431542 对细胞的增殖具有显著抑制作用，低剂量 SB431542（0、1、5、10 μmol/L）对于细胞的增殖没有抑制作用。

使用 qPCR 检测不同浓度药物影响的 P2 代人羊膜上皮细胞的基因表达水平情况。使用的Marker 为上皮标志物CK8、间充质标志物 ACTA2（α-SMA）、干细胞特性标志物 OCT4 和 KLF4。从实验数据来看（图 1B），5 μmol/L SB431542 和对照组 0 μmol/L SB431542 在 CK8 和 KLF4 的基因表达水平上具有显著性差异（< 0.05）。

综上，挑选最适药物浓度为 5 μmol/L SB431542完成后续对不同代次人羊膜上皮细胞的上皮表型影响的实验。

2.2 5 μmol/L SB431542 对人羊膜上皮细胞的增殖影响

记录每个代次 90% 融合度的细胞数和时间（h），计算每个代次细胞倍增所需要的时间。对照组为不加药的细胞，实验组为 5 μmol/L SB431542 处理的细胞。

实验数据（图 2）表明，P1 ~ P6 人羊膜上皮细胞加药和不加药的细胞倍增时间基本一致。在 P7 代，加药的细胞倍增时间为 43.5 h，不加药的细胞倍增时间为 61.4 h。5 μmol/L SB431542 在7 个代次内可维持羊膜上皮细胞的增殖。

图 1 5 μmol/L SB431542 为 hAECs 生长的最佳的浓度（A：每天将 CCK8 加入不同浓度 SB431542 培养的细胞中，根据OD450读数绘制生长曲线；B：使用 qPCR 检测不同浓度 SB431542 培养的 P2 hAECs 的生物标志物的表达水平情况；*P < 0.05）

Figure 1 5 μmol/L of SB431542 was considered as the optimal concentration [A: The growth curve was drawn based on the450read after CCK8 was added to cells cultured with different concentration of SB431542 each day; B: The expression of biological markers including cytokeratin 8 (CK8), mesenchymal marker ACTA2 (α-SMA), and stem cell markers OCT4 and KLF4 were assessed by qPCR analysis in P2 hAECs treated with SB431542 at different concentrations;*< 0.05]

图 2 5 μmol/L SB431542 对不同代次的人羊膜上皮细胞的倍增时间影响

Figure 2 Effect of SB431542 on doubling time of hAECs at different generation

2.3 5 μmol/L SB431542 对人羊膜上皮细胞的基因表达水平的影响

使用 qPCR 检测对照组和实验组 P1、P3、P7 代人羊膜上皮细胞的基因表达水平情况。使用的Marker 为上皮标志物角蛋白 8（CK8）和 19（CK19）、干细胞标志物 OCT4 和 KLF4、间充质干细胞标志物波形蛋白和 ACTA2（α-SMA）。从实验数据（图 3）来看，对照组和实验组在 CK8、CK19、KLF4、OCT4、波形蛋白和 ACTA2（α-SMA）的基因表达水平上都有显著性差异（< 0.05）。且在 P7 代时，实验组细胞的 CK8、CK19、KLF4、OCT4 的表达水平明显高于对照组细胞的表达水平；实验组细胞的 ACTA2（α-SMA）和波形蛋白明显低于对照组的表达水平。

图 3 使用 qPCR 方法检测对照组和实验组的 P1、P3、P7 hAECs 基因表达情况（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）

Figure 3 The qPCR analysis was performed to assess gene expression in the P1, P3 and P7 hAECs of the control and experimental groups (*< 0.05,**< 0.01,***< 0.001)

2.4 5 μmol/L SB431542 对人羊膜上皮细胞的表面标志物的影响

流式检测技术检测对照组和实验组 P3、P5、P7 代人羊膜上皮细胞的表面标志物的变化情况。使用的 Marker 为间充质标志物 CD146、CD105 和干细胞标志物 SSEA4。从实验数据（表 2）来看，P3 和 P5 代细胞的对照组的间充质标志物 CD146、CD105 的表达量都要比实验组的高，对照组 SSEA4 的表达量都要比实验组的低。

2.5 5 μmol/L SB431542 对人羊膜上皮细胞的蛋白表达的影响

免疫荧光检测 P1 和 P7 代人羊膜上皮细胞的表面标志物的变化情况。使用的 Marker 为上皮细胞标志物CK8 和 EpCAM、间充质干细胞标志物 α-SMA。从实验结果来看（图 4），P1 代实验组的 CK8 和 EpCAM 表达效果强于 P1 代对照组细胞，α-SMA 都为弱表达；P7 代实验组的 CK8 和 EpCAM 表达效果强于 P7 代对照组细胞，且 P7 代实验组的 α-SMA 基本不表达。

3 讨论

本研究证实了 TGF-β 抑制剂 SB431542 在人羊膜上皮细胞体外扩增过程中维持其上皮表型、保持干性的作用。新鲜分离的人羊膜上皮细胞表达高水平的上皮标志物 CK8 和低水平的间充质标志物 α-SMA。然而，随着传代次数的增加，CK8 的表达量减少，α-SMA 的表达量增加。α-SMA 是EMT 过程中蛋白组成的一部分[18]。由于 CK8 和 α-SMA 在 EMT 和 MET 过程中具有快速的调节作用，因此被选为首选的 EMT 标记物[19]。KLF4 在 EMT 过程中也被鉴定为 TGF-β 调控基因[20-21]。人羊膜上皮细胞具有较强的KLF4 表达，随着传代次数的增加，KLF4 表达逐渐减少，最终消失。波形蛋白的存在也被认为是细胞发生 EMT 的一个重要标志[22]。此外，在上皮细胞向间质转化的过程中，波形蛋白的表达已被证明会诱导细胞的表型、活力和细胞黏附能力发生改变[23]。

表 2 5 μmol/L SB431542 对于不同代数人羊膜上皮细胞的表面标志物影响

注：使用流式检测方法，观察对照组和实验组中 P3、P5、P7 hAECs 相关表面标志物的变化情况。

Note: The changes of surface markers of P3, P5 and P7 of hAECs between control group and experimental group were observed by flow cytometry.

在 P7 代时，使用 SB431542 处理过的人羊膜上皮细胞的 CK8、CK19、KLF4、OCT4 的基因表达水平高于对照组细胞的表达水平；实验组细胞的 ACTA2（α-SMA）和波形蛋白的基因表达水平低于对照组的表达水平。从实验数据可以看出，SB431542 在基因水平上有抑制人羊膜上皮细胞的 EMT 的发生，同时不影响人羊膜上皮细胞的干细胞标志物的表达。使用 SB431542 处理过的P3、P5 代人羊膜上皮细胞的间充质表面标志物CD146、CD105 的表达量都要比对照组的低，而 SSEA4 的表达量都要比对照组的高。实验结果表明，SB431542 在蛋白表达水平上能抑制人羊膜上皮细胞的 EMT 的发生，但同时促进干细胞特性相关蛋白 SSEA4 的表达。P1 代实验组的 CK8 和 EpCAM 表达效果强于 P1 代对照组细胞，α-SMA 都为弱表达；P7 代实验组的 CK8 和 EpCAM 表达效果强于 P7 代对照组细胞，且 P7 代实验组的 α-SMA 基本不表达。使用 SB431542 处理后的人羊膜上皮细胞在 P7 代仍能够形成紧密的“铺路石”上皮样，但是对照组的细胞呈间充质特点的“长梭形”。

图 4 5 μmol/L SB431542 对于不同代次羊膜上皮细胞的蛋白表达情况影响（对照组：未经 SB431542 处理的 hAECs；实验组：使用 5 μmol/L SB431542 处理过的 hAECs；荧光标记：绿色；DAPI：蓝色；标尺：50 μm）

Figure 4 Effect of 5 μmol/L SB431542 on protein expression in different generations of hAECs (Control group: hAECs without SB431542 treatment; Experimental group: hAECs treated by 5 μmol/L SB431542; Markers: Green; DAPI: Blue; Scale bar: 50 μm)

TGF-β 对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用。TGF-β 能够促进成纤维细胞的增殖[24]，抑制上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞的增殖[25]。同时 TGF-β 在治疗伤口愈合[26]，促进软骨和骨修复[27]以及通过免疫抑制治疗自身免疫性疾病[28]等方面有潜在的应用前景。在本研究中使用了 TGF-β 抑制剂 SB431542 处理了人羊膜上皮细胞，但其在体内的生物学安全性仍有待后续研究。

[1] Miki T, Lehmann T, Cai H, et al. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells, 2005, 23(10):1549-1559.

[2] Kellner S, Kikyo N. Transcriptional regulation of the Oct4 gene, a master gene for pluripotency. Histol Histopathol, 2010, 25(3):405- 412.

[3] Tan JL, Lau SN, Leaw B, et al. Amnion epithelial cell-derived exosomes restrict lung injury and enhance endogenous lung repair. Stem Cells Transl Med, 2018, 7(2):180-196.

[4] Rodriguez NS, Yanuaria L, Parducho KMR, et al. Liver-directed human amniotic epithelial cell transplantation improves systemic disease phenotype in hurler syndrome mouse model. Stem Cells Transl Med, 2017, 6(7):1583-1594.

[5] Wu Z, Hui G, Lu Y, et al. Human amniotic epithelial cells express specific markers of nerve cells and migrate along the nerve fibers in the corpus callosum. Neural Regen Res, 2012, 7(1):41-45.

[6] Yang SP, Yang XZ, Cao GP. Conjunctiva reconstruction by induced differentiation of human amniotic epithelial cells. Genet Mol Res, 2015, 14(4):13823-13834.

[7] Lange-Consiglio A, Accogli G, Cremonesi F, et al. Cell surface glycan changes in the spontaneous epithelial-mesenchymal transition of equine amniotic multipotent progenitor cells. Cells Tissues Organs, 2014, 200(3-4):212-226.

[8] Gonzalez DM, Medici D. Signaling mechanisms of the epithelial-mesenchymal transition. Sci Signal, 2014, 7(344):re8.

[9] Lamouille S, Xu J, Derynck R. Molecular mechanisms of epithelial- mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014, 15(3):178-196.

[10] Zhang J, Tian XJ, Xing J. Signal transduction pathways of EMT induced by TGF-β, SHH, and WNT and their crosstalks. J Clin Med, 2016, 5(4):E41.

[11] Medici D, Hay ED, Olsen BR. Snail and Slug promote epithelial-mesenchymal transition through beta-catenin-T-cell factor-4-dependent expression of transforming growth factor-beta3. Mol Biol Cell, 2008, 19(11):4875-4887.

[12] Barboni B, Russo V, Curini V, et al. Gestational stage affects amniotic epithelial cells phenotype, methylation status, immunomodulatory and stemness properties. Stem Cell Rev Rep, 2014, 10(5):725-741.

[13] Stadler G, Hennerbichler S, Lindenmair A, et al. Phenotypic shift of human amniotic epithelial cells in culture is associated with reduced osteogenic differentiation in vitro. Cytotherapy, 2008, 10(7):743-752.

[14] Inman GJ, Nicolás FJ, Callahan JF, et al. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol Pharmacol, 2002, 62(1):65-74.

[15] Laping NJ, Grygielko E, Mathur A, et al. Inhibition of transforming growth factor (TGF)-beta1-induced extracellular matrix with a novel inhibitor of the TGF-beta type I receptor kinase activity: SB-431542. Mol Pharmacol, 2002, 62(1):58-64.

[16] Matsuyama S, Iwadate M, Kondo M, et al. SB-431542 and Gleevec inhibit transforming growth factor-beta-induced proliferation of human osteosarcoma cells. Cancer Res, 2003, 63(22):7791-7798.

[17] Halder SK, Beauchamp RD, Datta PK. A specific inhibitor of TGF-beta receptor kinase, SB-431542, as a potent antitumor agent for human cancers. Neoplasia, 2005, 7(5):509-521.

[18] Kalluri R, Neilson EG. Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis. J Clin Invest, 2003, 112(12):1776-1784.

[19] Martinovic V, Vukusic Pusic T, Restovic I, et al. Expression of epithelial and mesenchymal differentiation markers in the early human gonadal development. Anat Rec (Hoboken), 2017, 300(7):1315-1326.

[20] Valcourt U, Kowanetz M, Niimi H, et al. TGF-beta and the Smad signaling pathway support transcriptomic reprogramming during epithelial-mesenchymal cell transition. Mol Biol Cell, 2005, 16(4): 1987-2002.

[21] Li XM, Kim SJ, Hong DK, et al. KLF4 suppresses the tumor activity of cutaneous squamous cell carcinoma (SCC) cells via the regulation of SMAD signaling and SOX2 expression. Biochem Biophys Res Commun, 2019, 516(4):1110-1115.

[22] Janda E, Lehmann K, Killisch I, et al. Ras and TGF[beta] cooperatively regulate epithelial cell plasticity and metastasis: dissection of Ras signaling pathways. J Cell Biol, 2002, 156(2):299-313.

[23] Mendez MG, Kojima S, Goldman RD. Vimentin induces changes in cell shape, motility, and adhesion during the epithelial to mesenchymal transition. FASEB J, 2010, 24(6):1838-1851.

[24] de Larco JE, Todaro GJ. Growth factors from murine sarcoma virus-transformed cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 1978, 75(8):4001- 4005.

[25] Moses HL, Roberts AB, Derynck R. The discovery and early days of TGF-β: a historical perspective. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2016, 8(7):a021865.

[26] Roberts AB. Transforming growth factor-beta: activity and efficacy in animal models of wound healing. Wound Repair Regen, 1995, 3(4): 408-418.

[27] Poniatowski ŁA, Wojdasiewicz P, Gasik R, et al. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators Inflamm, 2015, 2015:137823.

[28] Letterio JJ, Roberts AB. Regulation of immune responses by TGF-beta. Annu Rev Immunol, 1998, 16:137-161.

Effect of SB431542 on epithelial mesenchymal transformation of human amniotic epithelial cells

WANG Jing, DAI Cheng-xiang, LI Ping, SHEN Mei-ping, LI Su-ke, LIU Bi-zuo

Cellular Biomedicine Group, Shanghai 201210, China

SB431542 was added to control the stemness, phenotype and mesenchymal characteristics of human amniotic epithelial cells. The objective of this study is to provide evidence for the role of TGF-β inhibitor SB431542 in preventing epithelial mesenchymal transformation of human amniotic epithelial cells.

Different concentrations of SB431542 was used to culture P2 human amniotic epithelial cells, and the optimal concentration was selected through cell proliferation curve and gene expression (CK8, ACTA2, OCT4 and KLF4). Cells without SB431542 were used as the control group, while cells with SB431542 were experimental group. Cells doubling time, gene expression levels (CK8, CK19, OCT4, KLF4, Vimentin, ACTA2), the mesenchymal biomarkers (CD146, CD105, SSEA4) and epithelial biomarker levels (CK8, ACTA2, EpCAM) were detected by cellular number accounting, qPCR, flow cytometry and immunofluorescence, respectively, and compared between the control group and the experimental group.

When cultured P2 human amniotic epithelial cells were treated with different concentration of SB431542, the cell proliferation and the gene expression (CK8, ACTA2, OCT4 and KLF4) were the best after treatment with 5 μmol/L SB431542. Therefore, 5 μmol/L SB431542 was used in the following experiments. Under the culture condition of 5 μmol/L SB431542, the doubling time of P7 cell group was better than that of control group. Also, the gene expression levels of CK8, CK19, KLF4, OCT4 in P7 cell group with 5 μmol/L SB431542 were significantly higher than that in control group, while ACTA2 (α-SMA) and Vimentin in P7 cell group with 5 μmol/L SB431542 were significantly lower than that in control group. Expression levels of mesenchymal markers CD146, CD105 in P3 and P5 cells group with 5 μmol/L SB431542 were lower, while SSEA4 was higher, than that in the control group. The expressions of epithelial markers CK8 and EpCAM in the P7 cell group with 5 μmol/L SB431542 were higher than that in the P7 control group, while the α-SMA in the P7 experimental group was undetectable.

5 μmol/L SB431542 can inhibit the occurrence of epithelial mesenchymal transformation effectively in human amniotic epithelial cells culturedwithin 7 generations.

Human amniotic epithelial cells; TGF-β; SB431542; Epithelial mesenchymal transformation; Stem cells

·协会之窗·

中国医药生物技术协会积极配合多部委开展新冠肺炎干细胞治疗应急科研课题备案

新型冠状病毒感染作为一个全新的疾病，目前对其诊治还有很多处于摸索阶段，为此部分医疗机构提出了开展干细胞治疗新冠肺炎临床研究的课题，科技部也启动了相关的应急科研立项。为了加快相关干细胞临床研究的备案，中国医药生物技术协会作为干细胞临床研究备案技术审核单位，积极配合国家卫生健康委、国家药监局、科技部，开通干细胞治疗新冠肺炎临床研究备案审核的快速通道，组织专家提前介入，完善研究方案，协助相关课题的备案工作。

中国医药生物技术协会关于设立新分支机构的公告

根据《民政部关于贯彻落实国务院取消全国性社会团体分支机构、代表机构登记行政审批项目的决定有关问题的通知》（民发[2014]38 号）和《中国医药生物技术协会分支机构管理办法》等有关规定，由有关专家和机构发起，经协会第六届理事会第二次理事会议审议通过，决定设立“中国医药生物技术协会临床前评价技术专业委员会”、“中国医药生物技术协会临床研究专业委员会”、“中国医药生物技术协会神经修复与再生分会”、“中国医药生物技术协会医工结合分会”等4 个新分支机构。

LI Ping, Email: freezonli@aliyun.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.013

李萍，Email：freezonli@aliyun.com

2019-09-17

*同为第一作者