体色差异豹纹鳃棘鲈的色素及酶含量分析

邓 成,陈帅龙,叶恒振,齐兴柱,骆 剑

(海南大学南海海洋资源利用国家重点实验室海南省水产种业工程研究中心海南省热带水生生物技术重点实验室,中国海南 海口 570228)

豹纹鳃棘鲈(Plectropomus leopardus),俗称东星斑,属于鲈形目、鲈亚目、鮨科、鳃棘鲈属,为暖水性礁栖鱼类,广泛分布于太平洋西岸、印度洋等海域。豹纹鳃棘鲈的体色会随环境改变,体色鲜艳、变化丰富,是研究鱼类体色发育与变异的好材料。豹纹鳃棘鲈常规体色呈红色或鲜橘红色,全身布满蓝色或蓝白色的圆形或椭圆形斑点,而养殖个体常常呈现黑棕色。体色鲜红的豹纹鳃棘鲈很受市场欢迎,具有较高的经济价值。

目前,国内外学者在鱼类体色相关的机制方面已有初步研究[1～4]。鱼类的体色是由真皮层色素细胞的色素颗粒运动以及光反射器官的光散射产生的物理颜色,色素颗粒在细胞内延伸和扩散,从而改变体表的颜色。色素细胞及色素颗粒的分布、大小、种类、密度、排列方式的不同,很大程度上直接影响了鱼类体色的呈现结果[5]。依据包含的色素颗粒、色素、形态和运动型,色素细胞分为以下 6 种：黑色素细胞(melanophore)、白色素细胞(leucophore)、红色素细胞(erythrophore)、黄色素细胞(xanthophore)、蓝色素细胞(cyanophore)和虹彩色素细胞(iridophore)。黑色素细胞内含黑色素颗粒,分泌黑色素,使体表呈现黑色或者褐色。Fujii[6]的研究表明,体色深浅变化与黑色素颗粒聚集程度有关,颗粒距离越远,体色越浅。白色素细胞包含白色颗粒,分泌尿酸和鸟嘌呤,因反光使体表呈现白色。红色素细胞和黄色素细胞包含胡萝卜素和类胡萝卜素,色素细胞形成与脂肪代谢相关,呈现红色、橙色或者黄色。程炜轩等[7]在黄颡鱼中发现,黑色素缺失会使鱼体出现黄化现象。蓝色素细胞呈圆形;虹彩色素细胞呈棒状或颗粒状,包含反射小板,富含鸟嘌呤,细胞可排列形成光反射层。刘晓东等[8]在七彩神仙鱼中发现其表皮蓝条纹区有大量虹彩色素细胞和黑色素细胞。黑色素代谢酶(melanin metabolic enzyme,MME)是黑色素代谢的一种关键活性金属蛋白酶,该酶可将黑色素转化为氨基酸,从而清除机体表皮的黑色素。

鱼类在适应环境的过程中,会产生生理上的体色变化。其中,色素细胞可通过运动改变自身体色[9],同时也可通过色素细胞的增殖或者减少对体色产生影响。此外,光感受也会导致体色变化,例如光照周期、光照强度等会影响内分泌系统对酶活及色素细胞生成代谢的调控[10]。

本文首先对体色具有显著差异的豹纹鳃棘鲈个体的表观体色特征进行分类分析,然后检测体色差异样本的主要色素含量,同时判断体色差异是否与色素代谢酶的含量存在联系,以揭示豹纹鳃棘鲈体色变异的形态学和色素生理学规律,为探讨礁栖石斑鱼体色变异机制提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用豹纹鳃棘鲈采集于海南省琼海市鸿茂水产有限公司基地,从养殖群体中筛选体色差异较大的红色和黑色个体各30 尾,每尾体长为 35±5 cm,体重为 520±20 g。

1.2 实验分组

实验分为8 组：1)红色个体背部组(RB); 2) 黑色个体背部组(BB); 3) 红色个体腹部组(RF); 4) 黑色个体腹部组(BF);5) 红色个体尾部组(RW); 6) 黑色个体尾部组(BW);7)红色个体血液组(RX); 8) 黑色个体血液组(BX)。

1.3 体色观察

将采集到的样本放置于摄影灯箱内,使用索尼数码相机(DSC-WX500)拍照保存。采用Motic SMZ-168 体视系统记录皮肤色斑分布。

1.4 色素提取和酶含量分析

在实验样本中挑选出典型的红色或黑色个体各4 尾,采用手术刀及镊子将全部实验用鱼的背部、腹部、尾部皮肤组织(1 cm × 1 cm)取下,并快速放置于-80 ℃的冰箱内冷冻保存备用。采用10 mL注射器抽取样本血液于1.5 mL 离心管中,静置过夜后提取血浆保存于4 ℃冰箱备用。

对于豹纹鳃棘鲈组织样品的色素提取和黑色素酶含量的检测,本文主要参考鱼黑色素(Fish)酶联免疫分析试剂盒、鱼黑色素代谢酶(MME)酶联免疫分析试剂盒、鱼胡萝卜素(carotene)酶联免疫分析试剂盒、鱼类胡萝卜素(carotenoids)酶联免疫分析试剂盒中的操作步骤进行。所用试剂盒均购置于上海江莱生物科技有限公司。

1.5 统计分析

使用SPSS 18.0 分析软件对实验数据(平均值±标准差,±s)进行单因素方差分析,利用Duncan法进行多重比较,显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 豹纹鳃棘鲈的表观体色差异

本文选取了体色为红、黑的典型差异个体,在两种体色的豹纹鳃棘鲈表皮中均观察到黑色素细胞、红色素细胞。其中,黑色个体体表分布大量黑色素细胞(图1F～H),红色个体体表主要分布红色素细胞(图1C～E)。此外,我们在豹纹鳃棘鲈表皮观察中发现其背部和尾部的颜色较深,而腹部的颜色较浅(图 1A,1B)。

2.2 豹纹鳃棘鲈不同组织的黑色素含量

根据试剂盒操作说明对豹纹鳃棘鲈红、黑个体进行不同部位皮肤和血浆黑色素含量的测定,结果如图 2 所示。BB 组、BF 组、BW 组和 BX 组的黑色素含量分别为 10.46 μg/g、7.55 μg/g、9.83 μg/g、11.25 μg/g; RB 组、RF 组、RW 组和 RX 组的黑色素含量分别为 6.91 μg/g、4.56 μg/g、5.97 μg/g、7.17 μg/g。

对检测结果进行统计分析发现,黑色个体中,背部和尾部皮肤的黑色素含量无显著性差异(P＞0.05),但均显著高于腹部皮肤中的黑色素含量(P＜0.05);红色个体中,背部黑色素含量显著高于腹部皮肤中的黑色素含量(P＜0.05),而背部和尾部中的黑色素含量无显著性差异(P＞0.05)。此外,黑色个体在背部、腹部中的黑色素含量均显著高于红色个体;黑色个体血浆中的黑色素含量与红色个体血浆中的黑色素含量存在显著性差异。

2.3 豹纹鳃棘鲈不同组织中黑色素酶的含量

豹纹鳃棘鲈红、黑个体皮肤和血浆中黑色素酶的含量测定结果如图 3 所示。BB 组、BF 组、BW组、BX 组的黑色素酶含量分别为0.21 ng/g、0.19 ng/g、0.22 ng/g、0.13 ng/g;RB 组、RF 组、RW 组、RX 组的黑色素酶含量分别为0.32 ng/g、0.39 ng/g、0.30 ng/g、0.47 ng/g。在黑色个体,背部、腹部和尾部皮肤中的黑色素酶含量无显著性差异。就腹部皮肤而言,黑色素酶在红色个体中的含量显著高于黑色个体,但红色个体在背部和尾部皮肤中的黑色素酶含量无显著性差异。此外,黑色素酶含量在黑色个体血浆与红色个体血浆间存在显著性差异。

2.4 豹纹鳃棘鲈不同组织中类胡萝卜素的含量

BB 组、BF 组、BW 组和 BX 组的类胡萝卜素含量分别为 92.15 mg/g、62.64 mg/g、90.55 mg/g、173.64 mg/g; RB 组、RF 组、RW 组和 RX 组的类胡萝卜素含量分别为 140.66 mg/g、88.76 mg/g、147.73 mg/g、208.15 mg/g。红色个体中,背部和尾部皮肤的类胡萝卜素含量无显著性差异,但均显著高于腹部皮肤中的类胡萝卜素含量; 黑色个体中,背部和尾部皮肤的类胡萝卜素含量无显著性差异,但也均显著高于腹部皮肤中的类胡萝卜素含量。红色个体在不同组织中的类胡萝卜素含量均显著高于黑色个体(图4)。

图1 豹纹鳃棘鲈体色变异与表皮显微观察结果(A) 红色个体; (B) 黑色个体; (C) 红色个体背部表皮; (D) 红色个体腹部表皮; (E) 红色个体尾部表皮; (F) 黑色个体背部表皮; (G) 黑色个体腹部表皮; (H) 黑色个体尾部表皮。Fig.1 Microscopic observation of body color variation and epidermis of P.leopardus(A) The red individual; (B) The black individual; (C) Back epidermis of the red; (D) Abdominal epidermis of the red; (E) Tail epidermis of the red; (F) Back epidermis of the black; (G) Abdominal epidermis of the black; (H) Tail epidermis of the black.

图2 豹纹鳃棘鲈红、黑个体皮肤和血液中黑色素含量的比较图中a～e 不同字母表示组间存在显著性差异。BB：黑色个体背部皮肤;RB：红色个体背部皮肤; BF：黑色个体腹部皮肤;RF：红色个体腹部皮肤;BW：黑色个体尾部皮肤; RW：红色个体尾部皮肤;BX：黑色个体血液;RX：红色个体血液。Fig.2 Comparison of skin and blood melanin contents in red and black individuals of P.leopardusDifferent letters a ～e mean significant differences between groups.BB：Back skin of the blacks; RB：Back skin of the reds; BF：Abdominal skin of the blacks; RF：Abdominal skin of the reds; BW：Tail skin of the blacks; RW：Tail skin of the reds; BX：Blood of the blacks; RX：Blood of the reds.

图3 豹纹鳃棘鲈红、黑个体皮肤和血液中黑色素酶含量的比较BB：黑色个体背部皮肤; RB：红色个体背部皮肤; BF：黑色个体腹部皮肤; RF：红色个体腹部皮肤; BW：黑色个体尾部皮肤; RW：红色个体尾部皮肤; BX：黑色个体血液; RX：红色个体血液。Fig.3 Comparison of skin and blood melaninase con原tents in red and black individuals of P.leopardusBB：Back skin of the blacks; RB：Back skin of the reds; BF：Abdominal skin of the blacks; RF：Abdominal skin of the reds; BW：Tail skin of the blacks; RW：Tail skin of the reds;BX：Blood of the blacks; RX：Blood of the reds.

图4 豹纹鳃棘鲈红、黑个体不同组织类胡萝卜素含量的比较BB：黑色个体背部皮肤; RB：红色个体背部皮肤; BF：黑色个体腹部皮肤; RF：红色个体腹部皮肤; BW：黑色个体尾部皮肤; RW：红色个体尾部皮肤; BX：黑色个体血液; RX：红色个体血液。Fig.4 Comparison of the carotenoid content in different tissues of red and black individuals of P.leopardusBB：Back skin of the blacks; RB：Back skin of the reds; BF：Abdominal skin of the blacks; RF：Abdominal skin of the reds; BW：Tail skin of the blacks; RW：Tail skin of the reds;BX：Blood of the blacks; RX：Blood of the reds.

2.5 豹纹鳃棘鲈不同组织中胡萝卜素的含量

豹纹鳃棘鲈红、黑个体均进行了皮肤和血浆胡萝卜素的含量测定,结果如图5 所示。BB 组、BF 组、BW 组、BX 组的胡萝卜素含量分别为50.94 mg/g、33.09 mg/g、54.11 mg/g、103.30 mg/g;RB 组、RF 组、RW 组、RX 组的胡萝卜素含量分别为 80.91 mg/g、45.84 mg/g、85.62 mg/g、111.04 mg/g。

红色个体中,背部和尾部皮肤的胡萝卜素含量无显著性差异,但均显著高于腹部皮肤中的胡萝卜素含量; 黑色个体中,背部和尾部皮肤的胡萝卜素含量无显著性差异,但也均显著高于腹部皮肤中的胡萝卜素含量。红色个体在不同组织中的胡萝卜素含量均显著高于黑色个体。

3 讨论

3.1 皮肤和血液中胡萝卜素和类胡萝卜素含量与体色的关系

鱼类体色组成的基本色素包括黑色素、类胡萝卜素群、红色素、黄色素等。由于鱼体不能自身合成胡萝卜素和类胡萝卜素,需要通过摄食来获取,因此其着色程度受类胡萝卜素摄入量的影响。朱艺峰等[11]报道通过饲料中添加类胡萝卜素,可增加养殖鱼类的肌肉着色度。在花玛丽鱼的研究中,饲料中类胡萝卜素含量的差异,可导致个体呈现出不同的体色,其中在饲料中添加400 mg/kg类胡萝卜素对其体色的影响最为明显[12]。周邦维等[13]在有关豹纹鳃棘鲈生长发育所需营养物质的研究中发现,胡萝卜素的含量在很大程度上影响了豹纹鳃棘鲈皮肤中色素的含量。

图5 豹纹鳃棘鲈红、黑个体皮肤及血液中胡萝卜素含量的比较BB：黑色个体背部皮肤; RB：红色个体背部皮肤; BF：黑色个体腹部皮肤; RF：红色个体腹部皮肤; BW：黑色个体尾部皮肤; RW：红色个体尾部皮肤; BX：黑色个体血液; RX：红色个体血液。Fig.5 Comparison of the carotene content in different body parts of red and black individuals of P.leopardusBB：Back skin of the blacks; RB：Back skin of the reds; BF：Abdominal skin of the blacks; RF：Abdominal skin of the reds; BW：Tail skin of the blacks; RW：Tail skin of the reds;BX：Blood of the blacks; RX：Blood of the reds.

黄色、橙色和红色锦鲤所含的主要色素组分可能分别是α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和虾青素[14]。有研究表明,不同种群的红身蓝首鱼的着色变化取决于类胡萝卜素的含量与种类。在金色和灰色变种个体的皮肤中,类胡萝卜素含量具有显著性差异; 而在灰色向金色转变的样本中,与黑色素细胞的凋亡和类胡萝卜素的积累相关的基因呈现出显著的表达差异[15～17]。

本研究观察结果表明,豹纹鳃棘鲈各个部位皮肤的呈色存在差异,在红色和黑色个体中,背部和尾部的颜色均较深而腹部较浅,背部与尾部是红色素细胞与黑色素细胞分布集中的区域,而这些细胞在腹部的分布则比较稀疏。各部位色素含量的检测结果也显示,豹纹鳃棘鲈背部和尾部的色素含量较高,其中红色个体各部位的胡萝卜素与类胡萝卜素含量均显著高于黑色个体相应的部位; 腹部色素含量较低,红、黑个体腹部皮肤的胡萝卜素和类胡萝卜素含量在所有部位中最低,这与表观体色规律保持一致,说明胡萝卜素与类胡萝卜素对豹纹鳃棘鲈体色影响显著,两种色素含量越高,体色越鲜艳。尽管黑色个体的胡萝卜素与类胡萝卜素含量较红色个体而言整体偏低,但是在血浆中仍然有较高的含量,这说明皮肤对色素的吸收或代谢的差异,也是导致豹纹鳃棘鲈体色差异的重要原因。

3.2 黑色素、黑色素酶与豹纹鳃棘鲈体色的关系

黑色素细胞是皮肤中的一种特殊细胞,能够产生黑色素并且传递给周围的角质细胞,从而使皮肤呈现黑色和褐色。大菱鲆的白化与黑色素的含量有关,研究显示体色正常的个体与体色白化的个体在黑色素含量上有着显著的差异[18]。孔雀鱼中黑色素的形成由一对等位基因控制,显性基因个体的黑色素细胞可分泌丰富的黑色素,而隐性基因个体的黑色素细胞分泌黑色素较少[19]。在红鲫鱼中,黑色素细胞出现在胚胎和幼鱼的阶段,随着黑色素细胞的消失,红色鲫鱼的体色在形成过程中由深灰色变为红橙色[20]。本研究结果显示,在豹纹鳃棘鲈个体中,各个部位的黑色素含量均表现为黑色个体显著高于红色个体,这也与显微镜的观察结果相吻合。此外,豹纹鳃棘鲈腹部较浅,这也与其黑色素含量较低相关。

同时,本研究的检测数据显示,豹纹鳃棘鲈红、黑个体之间的色素差异也表现在血浆色素含量上,黑色个体与红色个体血浆中的黑色素含量分别为 11.25 μg/g 和 7.17 μg/g,存在显著性差异,这种差异可能与黑色素合成相关。酪氨酸蛋白酶的活性被广泛证明与黑色素生成呈正相关。相关研究报道,刺鼠信号蛋白会抑制酪氨酸蛋白酶的活性,进而减少黑色素的产量[21]; 熊果素和Vc 能抑制斑马鱼中酪氨酸酶的活性,进而抑制黑色素颗粒的生成量[22]。此外,饲料添加物、外部环境等也会影响黑色素的合成[13,23～24]。豹纹鳃棘鲈在野生环境下多呈红色,而网箱养殖群体多显色较深,这可能与其外部环境及饵料的改变相关。

黑色素酶主要在氨基酸氧化酶的作用下经脱氨基反应清除机体表皮沉淀的黑色素。本文的结果显示,豹纹鳃棘鲈红色个体中的黑色素代谢酶含量显著高于黑色个体,高水平的黑色素酶含量可能伴随较高的黑色素分解,从而导致红色色素更容易显现出来。鱼类通过内分泌调节色素细胞器的转运机制,通过酶代谢及激素作用的方式介导体色机制的改变[1]。豹纹鳃棘鲈红色个体血液中的黑色素酶含量为0.47 ng/g,而黑色个体血液中的含量仅为0.13 ng/g,二者间不仅存在显著性差异,且与黑色素含量呈现负相关。豹纹鳃棘鲈皮肤的黑色素含量显著影响了其呈色,而黑色素的含量不仅与黑色素的合成量相关,也与黑色素酶的活性相关,后者决定了黑色素的清除效率。

综上所述,豹纹鳃棘鲈皮肤黑色的呈现与黑色素和黑色素酶的含量相关; 而红色的呈现与胡萝卜素、类胡萝卜素等的含量相关; 其不同部位的皮肤的色素沉积和代谢存在显著差异。豹纹鳃棘鲈红、黑体色的差异可能主要通过色素细胞分布、色素的沉积机制、黑色素代谢机制共同调控。