不同试剂及温度对解除滇重楼种子休眠的影响

汪佳维，王华磊，赵 致，刘红昌，罗春丽，陈松树

(贵州大学 农学院/贵州省药用植物繁育与种植重点实验室，贵州 贵阳 550025)

滇重楼[Parispolyphyllavar.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz.]为延龄草科 (Trilliaceae) 重楼属(Paris)多年生草本植物，又名重楼一枝箭、独角莲、七叶一枝花和两把伞等，主要分布于云南、四川和贵州等地，生长于海拔1 400～3 100 m的常绿阔叶林、云南松林、竹林、灌丛或草坡中[1-2]，在抗癌、清热解毒、止血、抑菌、抗炎、防治心血管疾病等方面具有重要的药用价值[3-4]。

滇重楼种子存在较长的休眠期，需要经过两冬一夏才能出苗，且自然生长条件下出苗率低[5]，为滇重楼的人工种植增加了难度。滇重楼种子的休眠类型为综合性休眠，果实成熟后胚发育还不完全，且种皮和胚乳中存在萌发抑制物[6]。张家玲等[7]研究了不同激素处理对滇重楼种子萌发的影响，得出赤霉素(GA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)均可促进滇重楼种子的萌发。赵程等[8]研究了GA和氟啶酮(FL)协同作用对肉苁蓉种子发芽的影响，发现2种植物生长调节剂组合可有效提高肉苁蓉种子的发芽率。苏贺等[9]用GA和FL处理巫山淫羊藿种子，可有效打破其休眠。陈疏影等[10]研究表明，滇重楼更多还原种子层积过程中GA含量显著升高，ABA含量显著下降。在此基础上，采用不同浓度GA和FL及不同层积温度分别处理滇重楼种子，通过分析处理后种子的萌发情况，筛选解除滇重楼种子休眠的适宜方法，为滇重楼种苗的快速繁殖提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试滇重楼种子由云南红河学院薛春丽老师提供，采收后洗去外果皮，于阴凉通风处保存。供试主要试剂为GA和FL。

1.2 试验方法

1.2.1 滇重楼种子的千粒质量及吸水率变化 采用百粒法测定，每次随机取100粒种子，脱去外果皮，称其质量，重复10次，取平均值[11]。种子千粒质量(g)=10×平均100粒种子质量(g)。

将新鲜滇重楼种子洗去外果皮，晾干水分，取30粒称质量，作为吸水前的原始质量，在室温下置于烧杯中加蒸馏水进行吸胀，分别于 2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96 h取出种子，用滤纸吸干种子表面水分称质量，重复3次。根据吸水速率绘制吸水率曲线[12]。

种子吸水率(Yt)=(Xt-X0)/X0×100%，X0为30粒滇重楼种子的原始质量(g)，Xt为吸胀t小时30粒种子的质量(g)[13]。

1.2.2 不同植物生长调节剂对滇重楼种子发芽的影响 分别设置GA质量浓度为0、100、200、300、400、500、600 mg/L，对滇重楼种子进行浸种24 h处理，根据发芽率、发芽势和烂种率统计结果，选择发芽效果最好的3个GA质量浓度水平与4个FL质量浓度( 0、5、10、20 mg/L ) 完全组合，进行二因素完全随机试验设计，同时以蒸馏水预处理作对照(CK)。采用双层滤纸培养法，将预处理后的种子(种子无需消毒)置于垫有棉花及双层滤纸的培养皿上，每皿 100 粒，每个处理重复 3 次，于 20 ℃培养箱中培养。每隔3 d调查1次，胚根突破种皮视为发芽，调查过程中把烂种取出并计数，若发现滤纸发霉及时更换。

发芽率=累计发芽数/种子总数×100%，

发芽势=第30天的发芽数/种子总数×100%，

烂种率=霉烂种子数/种子总数×100%。

1.2.3 不同层积温度对滇重楼种子胚率的影响 设置恒温沙藏温度为0、5、10、20 ℃，变温沙藏温度为20 ℃(45 d)—5 ℃(30 d)—20 ℃(75 d)，以常温25 ℃作为对照。将洗去种皮的新鲜滇重楼种子用蒸馏水浸种24 h，移入装有湿沙的玻璃瓶中，每瓶100粒滇重楼种子，每个处理重复3次。每隔30 d取样1次，每次各处理取10粒种子，共取4次样。用解剖刀将种子沿中间对半切开，在体式显微镜下观察并测量种胚和胚乳的长度，计算平均胚率，然后统计和观察不同层积温度下滇重楼种子种胚的生长变化[10]，胚率=胚长/胚乳长。

1.3 数据分析

采用Excel 2010和DPS 2.0整理数据并进行统计及方差分析，用Duncan’s法进行种子发芽率、发芽势及烂种率的多重比较。

2 结果与分析

2.1 滇重楼种子的千粒质量及吸水率变化

经测定，滇重楼种子千粒质量为(51.34±0.03)g。由图1可以看出，吸胀0～24 h，滇重楼种子吸水率快速上升；吸胀24～60 h，种子吸水率上升趋势逐渐变缓；吸胀60 h后种子吸水率趋于稳定。整体来看，滇重楼种子的吸水性不强，吸水率最高仅为5.7%。

图1 滇重楼种子的吸水率曲线Fig.1 Water absorption rate curve in seeds of Paris polyphylla var.yunnanensis

2.2 不同质量浓度GA对滇重楼种子发芽的影响

2.2.1 发芽率 滇重楼种子从第20天开始陆续发芽。由表1可以看出，不同质量浓度GA处理滇重楼种子均能够发芽，且发芽率均高于对照，说明GA对滇重楼种子发芽具有促进作用。GA质量浓度为100～300 mg/L时滇重楼种子发芽率均较高，其中GA质量浓度为300 mg/L时发芽率达到最高(79.00%)，但3个质量浓度处理间无显著差异。GA质量浓度为400～600 mg/L时，滇重楼种子发芽率随GA质量浓度升高呈下降趋势。

表1 赤霉素对滇重楼种子发芽的影响Tab.1 Effects of gibberellin on seeds germination of Paris polyphylla var.yunnanensis %

注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。
Note:Different letters in the same column indicate significant difference(P<0.05).

2.2.2 发芽势 由表1所示，不同质量浓度GA处理的滇重楼种子发芽势均高于对照，且不同处理间差异显著，说明GA能显著提高滇重楼种子的发芽势。GA质量浓度为300 mg/L时发芽势最高(54.33%)，其次是200、100 mg/L处理，GA质量浓度为400～600 mg/L时发芽势降低。

2.2.3 烂种率 由表1所示，不同质量浓度GA处理下的滇重楼种子烂种率差异较大，100～300 mg/L GA处理时烂种率较低，且均与对照无显著差异。GA质量浓度为400～600 mg/L时，烂种率随GA质量浓度升高而逐渐加大，600 mg/L GA处理时烂种率达到最高(13.00%)，且与对照差异显著。说明滇重楼种子的烂种率随GA浓度升高而增加。

综上可得出，GA质量浓度为100、200、300 mg/L时有助于滇重楼种子的萌发，可用于后续与FL的组合试验。

2.3 不同质量浓度GA和FL组合对滇重楼种子发芽的影响

2.3.1 发芽率 由表2可见，单独使用GA、FL以及GA+FL组合对滇重楼种子发芽率的影响均达到极显著水平(P<0.001、P<0.004以及P=0.001)。由F值可以看出，GA对滇重楼种子发芽率的影响最大(F=70.598)，其次是GA+FL(F=18.680)，FL组合对滇重楼种子发芽率的影响最小(F=13.396)。

表2 赤霉素、氟啶酮组合对滇重楼种子发芽率的影响方差分析Tab.2 ANOVA for effects of gibberellin and fluridone on germination rate of Paris polyphylla var.yunnanensis seeds

由图2可见，单独使用FL处理滇重楼种子发芽率差异显著且总体上表现为低于单独使用GA处理和GA+FL组合，单独使用GA处理的发芽率较高且处理间差异不显著，GA+FL组合处理间差异显著。所有处理中以300 mg/L GA+10 mg/L FL处理(GA300+FL10)发芽率最高(81.33%)，其次是GA200+FL20处理(80.33%)，对照GA0+ FL0发芽率最低(19.33%)。

2.3.2 发芽势 由表3可见，单独使用GA、FL处理以及GA+FL组合对滇重楼种子发芽势的影响均极显著(P<0.001、P<0.004以及P=0.001)，由F值可以看出，GA对滇重楼种子发芽势的影响最大(F=48.187)，其次是FL(F=32.143)，GA+FL组合影响最小(F=17.291)。

由图3可见，单独使用FL处理间滇重楼种子发芽势差异显著且整体低于对照，单独使用GA及GA+FL组合的发芽势处理间差异显著。所有处理中，以GA300+FL0处理发芽势最高(54.33%)，其次是GA300+FL20处理(38.33%)，GA0+FL5处理发芽势最低，仅为2.67%。

GA、FL后数字表示质量浓度(mg/L);不同字母表示单独使用GA、FL以及GA+FL组合内分别差异显著(P<0.05The figures after GA and FL indicate the mass concentration(mg/L);Different letters indicate significant difference(P<0.05图2 赤霉素、氟啶酮组合对滇重楼种子发芽率的影响Fig.2 Effect of gibberellin and fluridone combination on seed germination rate of Paris polyphylla var.yunnanensis

表3 赤霉素、氟啶酮对滇重楼种子发芽势的影响方差分析
Tab.3 ANOVA for effects of gibberellin and fluridone on germination potential ofParispolyphyllavar.yunnanensisseeds

误差来源Errorsourcedf平方和Sumofsquares均方MeansquareFPGA33320.9171106.97248.187<0.001FL356.25018.75032.143<0.004GA+FL92727.866303.09617.291<0.001

图3 赤霉素、氟啶酮组合对滇重楼种子发芽势的影响Fig.3 Effect of gibberellin and fluridone combination on seed germination potential of Paris polyphylla var.yunnanensis

2.3.3 烂种率 由表4可见，FL处理对滇重楼种子烂种率影响极显著(P=0.006)，GA+FL组合处理影响显著(P=0.035)，GA处理对滇重楼种子烂种率影响不显著(P=0.216)。由F值可以看出，FL对滇重楼种子烂种率影响最大(F=12.250)，其次是GA+FL(F=4.142)，GA影响最小(F=2.000)。

表4 赤霉素、氟啶酮对滇重楼种子烂种率的影响方差分析 Tab.4 ANOVA for effects of gibberellin and fluridone on seed rotten rate of Paris polyphylla var.yunnanensis seeds

由图4可见，单独使用FL处理间滇重楼种子的烂种率差异显著，且随FL质量浓度增大而逐渐增大。单独使用GA的烂种率整体较低且与GA0+FL0(CK)差异不显著，GA+FL处理高于GA0+FL0(CK)。所有处理中，GA200+FL10处理烂种率最高(4.33%)，其次是GA100+FL20处理(4.00%)，GA100+FL0、GA300+FL0处理最低(均为0.67%)。

图4 赤霉素、氟啶酮组合对滇重楼种子烂种率的影响Fig.4 Effect of gibberellin and fluridone combination on seed rotten rate of of Paris polyphylla var.yunnanensis

通过对GA、FL处理滇重楼种子发芽率、发芽势及烂种率的统计分析可得出，单独使用GA、FL和GA+FL组合都能有效解除滇重楼种子的休眠。GA、FL和GA+FL组合处理滇重楼种子发芽率影响均极显著；对于发芽势，影响最显著的是GA，其次是FL；对于烂种率，FL影响极显著，且随FL质量浓度增加而增大，GA处理烂种率较低。

2.4 不同层积温度对滇重楼种子胚率的影响

由图5可见，滇重楼种子胚率总体上随层积时间推移逐渐增大，不同层积温度处理种子胚率的增长速度不同。0、5、10 ℃低温条件下种子胚率增长缓慢，且低于对照(25 ℃)；20 ℃条件下滇重楼种子胚率增长最快，远高于对照(25 ℃)，到层积60 d左右时，胚突破种皮开始萌发；变温[20 ℃(45 d)—5 ℃(30 d)—20 ℃(75 d)]下，在45 d后放入5 ℃环境开始胚率增长速度与恒温20 ℃相比明显下降且与对照(25 ℃)增长速度相差不大，即使在75 d后再次放回20 ℃环境中胚率增长也比较缓慢。说明低温、常温、变温处理都不能很好地解除滇重楼种子的休眠，而在恒温20 ℃条件下可以在较短时间内打破种子休眠。

图5 滇重楼种子不同温度层积过程中胚率的变化Fig.5 Embryo rate change during different temperature stratification of Paris polyphylla var.yunnanensis

3 结论与讨论

滇重楼种子具有较长的休眠期，休眠类型为综合性休眠，其形态休眠中的胚休眠是滇重楼种子休眠的主要因素，种子中存在萌发抑制物抑制胚的形态后熟[6]；在滇重楼种子的生长发育过程中，GA、IAA、ZR含量显著升高，ABA含量显著下降且变化量较大[14-15]。目前，在激素处理方面，可以通过添加2，4-D、NAA、GA等促进滇重楼种子的萌发[16-18]。本试验中，单独使用GA处理滇重楼种子也表现出了促进使用，另外还发现，随着GA质量浓度的进一步增加，其发芽率、发芽势逐渐降低，烂种率加大。FL可以抑制种子类胡萝卜素的合成从而减少ABA的合成[19]。GA+FL组合作用可有效促进滇重楼种子的发芽，发芽率最高的处理出现在GA+FL组合中(GA300+FL10，81.33%)，与张家玲等[7]得出的500 mg/L GA处理的滇重楼种子发芽率(82.36%)相当，但在此基础上降低了GA的使用浓度，且与使用500 mg/L GA相比降低了发芽时的烂种率。因此，确定GA300+FL10为解除滇重楼种子休眠的最佳植物生长调节剂处理。

滇重楼种子存在生理休眠，需要经过一定的层积处理打破休眠。有研究表明，低温沙藏可以促进北沙参种子的萌发[20]，打破铁包金种子休眠[21],显著提高种子发芽势与发芽率。关于滇重楼种子最适萌发温度的研究中，大多数认为恒温20 ℃为最佳温度，也有研究认为变温层积可在较短时间打破滇重楼种子休眠[7]。本研究通过对不同温度层积处理下滇重楼种子胚率的变化研究可以发现，滇重楼种子胚的生长变化与温度有很大的联系，不同温度下胚的生长变化差异极显著。在常温(25 ℃)、低温(0、5、10 ℃)以及变温(20 ℃—5 ℃—20 ℃)条件下胚率增长缓慢，不能有效打破滇重楼种子的休眠，只有在恒温20 ℃条件下胚率增长较快，可有效打破休眠，与李宝等[17]的研究结果一致，且在层积60 d左右时胚就突破种皮开始萌发。