不同施氮量对枸杞甜菜碱及相关酶的影响

刘根红，周佳瑞，郑国琦，任斌

(宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021)

枸杞(LyciumbarbarumL.)为茄科枸杞属多年生落叶灌木，喜阴凉气候，抗逆性较强.人工种植己有上千年历史，主要分布在宁夏、内蒙古、新疆等省区的干旱和半干旱地区[1-2].近年来宁夏枸杞种植面积近60 万hm2，占全国种植面积的26%，宁夏枸杞出口量占全国65%，产值达10亿元，成为宁夏经济的支柱产业之一[3].枸杞含有丰富的营养成分和药理活性成分，是我国传统的名贵中药材，具有补肾养肝、滋肺明目、补虚劳、强筋骨等功效[4].甜菜碱是枸杞子中主要有效成分之一，是一种水溶性生物碱，是甘氨酸甜菜碱( Glycinebetaine，GB)的简称，化学名称为N-甲基代氨基酸，广泛存在于植物中.甜菜碱作为抗逆渗透调节物质，在很多植物中都有相关研究[5].Robinson等[6]对盐胁迫下的菠菜进行细胞定位分析，结果表明受胁迫组织中，渗透势下降的64%是来自于甜菜碱.近代药理研究表明，枸杞子有降血脂、保肝、抗脂肪肝、抗癌及生长刺激等作用，这与甜菜碱的药理作用相一致[7].枸杞作为基础药材，其成分含量直接影响中药质量，而其有效成分含量与环境条件、栽培条件密切相关.随着现代药理学的发展，对枸杞药理作用的成分研究也越来越深入[8-9].甜菜碱作为枸杞子主要代谢物质，其含量决定枸杞子品质.甜菜碱作为一种渗透调节物质，其以胆碱为底物经两步酶催化氧化生成，即胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱.在高等植物中，催化第1步反应的是胆碱单加氧酶，催化第2步反应的是甜菜碱醛脱氢酶(BADH).这2种酶均由单一核基因编码并存在于叶绿体基质内[10]，在逆境胁迫下活性增强，在光诱导下促进甜菜碱的最终合成.

施肥量与施肥种类是影响甜菜碱变化的重要因子之一[11-12].刘建文等[13]研究认为，磷肥施用量对枸杞多糖、甜菜碱的含量影响不大，对枸杞黄酮含量有显著影响.不同收获时期[14]、灌水量[15]对枸杞次生物质含量的影响也不同.大多研究更集中于外界逆境条件下，枸杞甜菜碱及相关酶会累积[16-19].氮肥是枸杞需求量最大的营养元素，其施用量与施用方式和甜菜碱及代谢相关酶均有很大相关性[20、21]，关于甜菜碱及相关酶在菠菜等其它植物中有相关研究[22]，在枸杞上研究多集中于施氮量、施氮方式与枸杞甜菜碱含量之间的关系.如康建宏[23]等研究认为不同的施氮水平下枸杞主要次生代谢产物甜菜碱、类胡萝卜素、黄酮的含量存在着差异.适宜的施氮量(600～ 900 kg/hm2)对枸杞类胡萝卜素等次生代谢物质的形成和积累有利.张建青[24]等研究得出了青海格尔木地区枸杞较高产量水平氮素施量.但施氮量对枸杞甜菜碱及代谢关键酶的作用机理研究还不深入，为明确施氮量与枸杞甜菜碱及代谢关键酶间关系，进一步从基因水平解释其影响机制，必须先明确枸杞施氮量与甜菜碱及代谢关键酶之间的关系.因此，开展氮素不同施量对枸杞甜菜碱及其代谢关键酶的影响，对深入研究枸杞品质化栽培具有重要意义.

前期研究基本明确了施氮深度与施氮比例对枸杞甜菜碱及代谢关键酶的影响[25]，但对不同施氮量水平下，枸杞甜菜碱及关键酶变化仍不明确.因此本试验选择5年龄宁夏枸杞，设计不同施氮量，通过在枸杞生长期间对其冠幅、枝条数和产量、甜菜碱含量及其代谢关键酶活性变化的测定，研究宁夏枸杞施氮量与甜菜碱含量及其代谢关键酶之间的关系，明确适宜甜菜碱含量条件下科学施氮量，为宁夏枸杞的品质化栽培提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2019年4～10月在宁夏农垦南梁农场(E106°13′，N 38°40′)进行，海拔1 090 m.典型大陆性气候，干旱少雨，年降雨量约250 mm，热量充足，温差大，无霜期较短.土壤以盐分较高的灌淤土为主[2]，该地区种植的枸杞总面积达1 000万m2.

1.2 试验材料

以5年龄枸杞品种“宁杞7号”为试材.

1.3 试验设计

选取宁夏枸杞典型生态区(含盐量0.2%)盐渍化土壤，在常规灌水量(200 m3/666.7 m2)、常规磷肥施量(纯磷30 kg/666.7 m2)，常规施钾量(纯钾20 kg/666.7 m2)，常规有机肥(氮素含量0.53%)施用量(基施腐熟有机肥3 000 kg/666.7 m2)条件下，采取随机区组设计方法，设氮素从低到高5个不同水平，N0(0 kg/666.7 m2)、N1(20 kg/666.7 m2)、N2(30 kg/666.7 m2)、N3(40 kg/666.7 m2)、N4(50 kg/666.7 m2),氮素基追比1∶2∶1；每个处理设20棵树，树与树之间距离1 m，间隔3 m，小区面积72 m2，重复3次，试验区总面积1080 m2(375棵树)，磷肥钾肥统一做底肥，供试肥料为尿素(氮素含量46%)，施肥时期以4月中旬开沟基追施并灌水、6月初结合锄草追肥1次，8月初结合中耕追肥1次，氮肥施深30 cm；水平方向距离树干30～40 cm，其他田间管理同大田生产.

1.4 试验方法

1.4.1 甜菜碱的检测 测定甜菜碱的试验原理[26-28]，甜菜碱水解后与硫氰化铬铵(雷氏盐)生成紫红色沉淀：

C6H11O2NH++[Cr(NH3)2(SCN)4]→C6H11O2NH[Cr(NH3)2(SCN)4]↓

将甜菜碱与雷氏盐在酸性条件下反应制成雷氏盐沉淀，并用70%丙酮溶解，呈粉红色.在525 nm处以70%丙酮作空白对照测定吸光值，绘制标准曲线，然后利用该标准曲线测定被检物中甜菜碱含量.

1.4.2 甜菜碱醛脱氢酶(BADH)与单加氧酶的检测 参考梁峥[27]和骆爱玲等[28]方法.在4 ℃条件下，取50 g鲜样于100 mL研磨介质中研磨匀浆.研磨介质的组成是100 mmol/LTirs-HCL(pH8.0)，2 mmol/L二硫苏糖醇，1%聚乙烯毗咯烷酮和0.4 mol/L蔗糖.匀浆经一层孔径为40×40 μm的尼龙布过滤，过滤物于1 000g离心10 min，然后用10 000g再离心20 min，沉淀用10 mL悬浮介质悬浮，上清液部分如前述加硫酸铁使其浓度达到60%(7 g/100 mL上清液)，然后10 000g离心20 min，沉淀用1 mL悬浮介质悬浮.悬浮介质的组成是10 mmol/LTris-HCI(pH8.0)，10 mmol/Lβ一疏基乙醇和10%甘油(V/V).得到的悬浮物过Sephadex G-25柱(1.6×7.0 cm，LKB)，柱预先用同样缓冲液平衡.蛋白质用同样缓冲液洗脱,流速为1 mL/min,分管收集，每管1 mL.取带甜菜碱醛脱氢酶活性峰的管作试验.

单加氮的测定：吸取150 μL溶浆，加入3 μL 20 umol/L7-乙氧基香豆素(7-EC)，设2个重复，30 ℃水浴，让其反应4 h后，加入210 μL 0.6 mmol/L甘氨酸缓冲液终止反应，选择450 nm波段测吸光度值，共读取2次，每次间隔2 min，取平均值.

过氧化氢酶测定：甜菜碱醛脱氢酶的活性用分光光度法测定.终体积为1 mL的反应介质中含有100 mmol/LTirs-HCl(pH8.0) 0.5 mmol/LNAD，5 mmol/L二硫苏糖醇，1%聚乙烯毗咯烷酮和0.4 mol/L蔗糖.0.5 mmol/L甜菜碱醛(Sigma产品)和酶.反应由加人甜菜碱醛启动.酶活性由340 nm光密度的增加计算.对无氧的测定,，所有试剂预先通人纯氢气将氧彻底除去.

1.4.3 净光合速率测定 在5月初开始测定枸杞叶片净光合速率，选择晴天8∶00～11∶30时测定，14∶30后顺沿测定，每隔15 d测定1次，使用汉莎公司TPS-2型便携式光合测定系统在田间直接测定枸杞叶片的净光合速率(Pn，μmolCO2/(m2·s))，每个处理测定15片叶，每片叶记录两次稳定数据，测定时要求光照强度大于900 Lx.

1.4.4 产量计算 在每个处理中随机各选取单棵枸杞树6棵，记录每次采摘单棵树的枸杞果实质量，得出各处理单棵树产量，每666.7 m2可种植枸杞树222棵，由此推算出枸杞果实666.7 m2产量.

1.5 数据处理

使用EXCEL 2010进行数据及方差分析.

2 结果与分析

2.1 不同施氮量对枸杞果实甜菜碱含量的影响

图1表明，枸杞果实甜菜碱含量随施氮量的增加呈现出先上升后下降的趋势，在30 kg/666.7 m2(N2)水平时甜菜碱含量达到最大值，平均为2.90 mg/kg，在N2水平基础上再增加氮肥施用量，甜菜碱含量则下降，在不施氮肥(N0)时甜菜碱含量最低，平均为2.42 mg/kg.各时期方差测验结果表明，7月10日前不同时期各处理间差异不显著，在7月20～8月20日，施氮量水平30 kg/666.7 m2(N2)与其它施氮水平间达到极显著差异(P<0.01).甜菜碱含量最大值与最小值相差约19.8%，说明氮肥施用量影响枸杞果实甜菜碱含量，在30 kg/666.7 m2(N2)水平时甜菜碱含量达到最大值.对同一处理不同时期枸杞果实甜菜碱含量的研究表明，秋果(9月收获)甜菜碱平均含量为3.01 mg/kg，夏果(5～8月收获)甜菜碱平均含量为2.64 mg/kg，秋果甜菜碱含量高于夏果甜菜碱含量约14.1%.这可能是由于夏果收获时对枸杞只在4月中旬开沟基追施与6月初结合锄草追肥1次， 8月初结合中耕追肥1次，秋果短期内收获时施氮量瞬时增加所致.总体看，夏果枸杞N2水平对于枸杞果实甜菜碱的形成与积累有利.

图1 不同施氮量枸杞果实甜菜碱含量Figure 1 Betaine content in loquat fruit with different nitrogen application rates

2.2 不同施氮量对枸杞相关酶活性的影响

2.2.1 不同施氮量对枸杞叶片BADH活性的影响 不同施氮量对枸杞叶片BADH活性影响的研究表明(图2)，枸杞叶片中BADH活性随施氮量增加呈现出先下降后上升再次下降的趋势，在30 kg/666.7 m2(N2)处理时BADH达到最大值，平均为1.86 ng/100 μg，在不施氮肥(N0)时BADH平均活性为1.81 ng/100 μg，在20 kg/666.7 m2(N1)与50 kg/666.7 m2处理时BADH活性最低(6月20日后各处理间达5%差异显著水平)，平均为1.65 ng/100 μg，BADH活性最大值与最小值之间相差约10.0%，说明氮肥施用量影响着BADH活性，在氮肥施用量为30 kg/666.7 m2时效果达到最佳.对同一处理不同时期枸杞叶片中的BADH活性的研究表明：BADH含量整体呈现上升趋势，BADH随着枸杞叶片生长推移其活性增强，在枸杞叶片生长初生期BADH活性平均为1.45 ng/100 μg，叶片生长后期BADH活性最强，平均为2.07 ng/100 μg，叶片生长后期比初生期BADH活性强42.8%.这可能与土壤中氮素含量多少有关，枸杞在叶片生长初期只进行了氮肥早期1次追施，叶片生长后期氮肥已进行了3次追施，说明氮肥的施肥量对枸杞叶片BADH活性具有很大影响.

图2 不同施氮量枸杞叶片BADH活性Figure 2 BADH content in barbarum leaves of different nitrogen application amount

2.2.2 不同施氮量对枸杞果实BADH活性的影响 不同施氮量对枸杞果实BADH活性影响的研究表明(图3)，枸杞果实BADH活性整体随施氮量增加呈现出先上升后下将的趋势，在30 kg/666.7 m2(N2)处理时达到最大值，平均为3.71 ng/100 μg，氮肥施用量过多反而会使枸杞果实BADH活性呈现下降趋势，在50 kg/666.7 m2(N4)处理时达到最小值(7月10日后各处理间达5%异显水平)，平均为3.35 ng/100 μg，说明氮肥施用量影响着枸杞果实BADH活性，施氮量在30 kg/666.7 m2(N2)时达到最佳效果，再多施氮肥会使枸杞果实BADH活性下降.对于同一处理不同时期枸杞果实BADH活性的研究表明，枸杞果实BADH活性整体呈现上升趋势，夏果BADH活性平均为3.41 ng/100 μg，秋果BADH活性平均为4.13 ng/100 μg，秋果BADH活性高出夏果约21.1%.在夏果收获期还未进行第3次追肥处理，秋果收获期已经完成了三次基追肥处理，说明氮肥的施用量对枸杞果实BADH形成与积累有积极作用.

图3 不同施氮量枸杞果实BADH活性Figure 3 BADH content of wolfberry fruits with different nitrogen application rates

2.2.3 不同施氮量对枸杞叶片单加氧酶活性的影响 不同施氮量对枸杞叶片单加氧酶活性影响的研究表明(图4)，枸杞叶片单加氧酶活性随氮肥施用量增加呈先增加后下将的趋势，在30 kg/666.7 m2(N2)处理时达到最大值，平均为1.91 ng/100 μg，氮肥施用量再继续增加会使枸杞叶片单加氧酶的活性下降，在20 kg/666.7 m2(N1)处理时为最小值(7月10日后各处理间达5%异显水平)，平均为1.63 ng/100 μg，枸杞叶片单加氧酶活性受氮肥施用量的影响较为明显，施氮量在30 kg/666.7 m2(N2)处理时效果最佳，继续施氮肥会使枸杞叶片单加氧酶活性下降，在不施氮肥(N0)处理时单加氧酶活性高于N1处理，这可能是因为在盐胁迫条件下合成甜菜碱的相关酶活性会上升，这与逆境胁迫下研究结果一致[17-19].对于同一处理不同时期枸杞叶片单加氧酶活性的研究表明，枸杞叶片单加氧酶活性整体随生育期呈现上升趋势，叶片初生期单加氧酶平均活性为1.34 ng/100 μg，叶片生长后期单加氧平均活性为2.21 ng/100 μg，叶片生长后期单加氧酶活性高出叶片初生期约64.9%，生长后期的叶片单加氧酶活性均值远高于生长初期的叶片，其原因可能与甜菜碱醛脱氢酶变化原因类似.说明氮肥的施用量对枸杞叶片单加氧酶的形成与积累有积极作用.

图4 不同施氮量枸杞叶片单加氧酶活性Figure 4 Monooxygenase content in barbarum leaves of different nitrogen application rates

2.2.4 不同施氮量对枸杞果实单加氧酶活性的影响 不同施氮量对枸杞果实单加氧酶活性影响的研究表明(图5)，枸杞果实单加氧酶活性随氮肥施用量的增加整体呈现先下降后上升再下降的趋势，在30 kg/666.7 m2(N2)处理时单加氧酶活性达到最大值，平均为4.36 ng/100 μg，在50 kg/666.7 m2(N4)处理时单加氧酶活性达到最小值，平均为4.10 ng/100 μg，各时期方差测验结果表明，7月1日前不同时期各处理间差异不显著，在7月底30 kg/666.7 m2(N2)与其它施氮水平间达到极显著(1%)差异.在不施氮肥(N0)处理时平均活性为4.32 ng/100 μg，说明氮肥施用量对枸杞果实单加氧酶活性有影响，在30 kg/666.7 m2(N2)处理时达到最佳效果，过多施用氮肥会使单加氧酶活性下降，无氮处理(N0)时在氮胁迫下单加氧酶活性上升，这与陈少良研究结果一致[16].对于同一处理不同时期枸杞果实单加氧酶活性的研究表明，枸杞果实单加氧酶活性整体呈现先下降后上升的趋势，夏果单加氧酶活性平均为4.18 ng/100 μg，秋果单加氧酶活性平均为4.51 ng/100 μg，秋果单加氧酶活性高出夏果约7.9%(各处理间7月10日～8月20日达5%差异水平，8月20日后达1%差异水平)，在6～7月收获的果实单加氧酶活性呈现缓慢下降趋势，这可能与叶片单加氧酶变化的原因类似.说明氮肥的施用量增加对枸杞果实单加氧酶形成与积累比较敏感且有着积极作用.

图5 不同施氮量枸杞果实单加氧酶活性Figure 5 Monooxygenase content of wolfberry fruits with different nitrogen application rates

2.3 不同施氮量对枸杞净光合速率的影响

不同施氮量对枸杞净光合速率影响的研究表明(图6)，净光合速率整体随着施氮量水平的增加呈现先上升后下降的趋势，在30 kg/666.7 m2(N2)处理时达到最大值(各时期与其它处理均达5%差异水平)，平均净光合速率为32.5 μmol/(m2·s)，在不施氮肥(N0)处理时为最小值，平均净光合速率为22.0 μmol/(m2·s)，说明氮肥施用量对枸杞净光合速率有影响，在30 kg/666.7 m2(N2)处理时达到最佳效果，过多施用氮肥反而会使净光合速率下降.

图6 不同施氮量枸杞净光合速率Figure 6 Net photosynthetic rate of wolfberry with different nitrogen application rates

2.4 不同施氮量枸杞果实产量指标的影响

2.4.1 不同施氮量对枸杞果实直径的影响 不同施氮量对枸杞果实直径影响的研究表明(图7)，枸杞果实直径随着施氮量的增加呈现出先上升后下降的趋势，在30 kg/666.7 m2(N2)处理时达到最大值，平均为9.9 mm，在无氮处理(N0)处理时直径最小，平均为8.8 mm.各水平在不同时期均达到1%显著水平，说明氮肥施用量影响着枸杞果实的直径，在30 kg/666.7 m2处理时达到最佳效果，但氮肥施用量超过30 kg/666.7 m2时枸杞果实直径会出现下降趋势.

2.4.2 不同施氮量对枸杞果实粒长的影响 不同施氮量对枸杞果实粒长影响的研究表明(图8)，枸杞果实粒长随着施氮量的增加呈现出先上升后下降的趋势，在30 kg/666.7 m2(N2)处理时达到最大值，且7月30后与其他水平间达5%差异水平，平均枸杞粒长为19.4 mm，在无氮处理(N0)处理时直径最小，平均为16.8 mm，说明氮肥施用量影响着枸杞果实的直径，在30 kg/666.7 m2处理时达到最佳效果，氮肥施用量超过30 kg/666.7 m2时枸杞粒长会出现下降趋势.

图7 不同施氮量枸杞果实直径Figure 7 Diameter of wolfberry fruits with different nitrogen application rates

图8 不同施氮量枸杞果实粒长Figure 8 Wolfberry fruit grain length with different nitrogen application rates

2.4.3 不同施氮量对枸杞果实百粒重的影响 不同施氮量对枸杞果实百粒重影响的研究表明(图9)，枸杞果实百粒重随着施氮量的增加呈现出先上升后下降的趋势，在30 kg/666.7 m2(N2)处理时达到最大值，各时期与其它水平均达5%差异水平，平均为64.4 g，在无氮处理(N0)处理时百粒重最小，平均为59.1 g，说明氮肥施用量影响着枸杞果实的百粒重，在30 kg/666.7 m2处理时达到最佳效果，但是氮肥施用量超过30 kg/666.7 m2时枸杞果实百粒重会出现下降趋势.

图9 不同施氮量枸杞果实百粒质量Figure 9 Grain weight of wolfberry fruit with different nitrogen application rates

2.4.4 不同施氮量对枸杞产量的影响 不同施氮量对枸杞产量影响的研究表明(图10)，枸杞果实产量随着施氮量的增加呈现出先上升后下将的趋势，在30 kg/666.7 m2(N2)水平时产量达到最大值(1%)487 kg/666.7 m2，在不施氮肥(N0)处理时产量为最低水平407 kg/666.7 m2，说明氮肥的施用量影响着枸杞果实的产量，施肥量30 kg/666.7 m2时产量达到最佳水平，超出30 kg/666.7 m2此施氮水平时产量会随着施氮量增加而呈现下降趋势.

图10 不同施氮量枸杞产量Figure 10 The yield of wolfberry with different nitrogen application rates

3 讨论

作为具有明显地域特色的经济作物，研究宁夏枸杞的产量与品质均具有重要意义[14].甜菜碱影响枸杞品质的重要次生物质之一.一般认为，甜菜碱作为一种重要代谢调节物质，逆境是刺激其积累的主要原因[1、5、9].本研究通过在不同施氮量对枸杞甜菜碱活性及相关酶影响的研究表明，随施氮量的增加，枸杞果实中甜菜碱含量、相关酶，净光合速率及产量均有增加趋势，当施氮量达到30 kg/666.7 m2，甜菜碱含量及相关酶、净光合速率和产量均达到最佳水平，再增加氮肥施用量，会使相关指标呈现下降趋势.这与王益民[9]、贺春燕[12]的研究一致.BADH与单加氧酶是甜菜碱代谢的重要酶，甜菜碱含量变化趋势与其代谢关键酶的变化趋势基本一致，其相应生长指标也随施氮量呈现一致变化趋势，如枸杞净光合速率在施氮量30 kg/666.7 m2时明显高于其他各组，枸杞产量在此条件下也达到最高值，康建宏[23]研究有所差异.康建宏研究认为氮素的施用对宁夏构杞产量与品质存在矛盾，为协调产量与品质的一致氮肥施用量建议为 600～ 900 kg/hm2，但其研究的品质主要除甜菜碱外还有多糖、类胡萝卜素、黄酮等物质，甜菜碱的积累与黄酮等物质趋于负相关，但本研究发现，在氮素施量30 kg/666.7 m2时以甜菜碱为主及其代谢酶累积及产量变化均趋于一致，氮素施用量最佳水平低于其结论，这主要可能与枸杞生长年限有关.氮肥施用量过多不利于BADH的积累，在不施氮肥(N0)水平氮胁迫会使BADH活性增强，这与逆境胁迫下研究结果一致[16-19].

本研究与现有研究不同地方，低氮水平与较高氮水平枸杞甜菜碱含量均相应较高.甜菜碱是枸杞主要次生物质，很多研究表明逆境条件会促进枸杞甜菜碱含量增加，但另一方面，枸杞甜菜碱的合成是以氮素为必要元素，氮素的不足直接限制其甜菜碱合成，适量施用氮肥理论上利于甜菜碱的合成.因此甜菜碱的合成是逆境条件刺激与氮素量供给共同作用的结果.不施氮肥(N0)处理，枸杞果实甜菜碱含量与枸杞果实与叶片中BADH和单加氧酶活性均高于N1处理，这与现有研究逆境与甜菜碱及累积关系有关[16-19].由于试验地含盐量较高(0.2%)，盐分胁迫可能是导致其甜菜碱及相关酶积累量增加的主要原因；同时低氮水平枸杞果实产量相对较低.通过对枸杞叶片中的BADH与单加氧酶活性的研究表明，2种酶的活性随氮肥施用量变化与枸杞果实中酶活性变化趋势相同，枸杞果实中的BADH与单加氧酶活性远高于叶片中酶的活性，这一点未见相关报道.

4 结论

不同施氮量下枸杞甜菜碱活性、相关酶、净光合速率以及产量都存在差异，随着施氮量的增加甜菜碱质量分数、相关酶、净光合速率及产量都呈现上升趋势，甜菜碱及相关酶累积的最佳氮肥施用量为30 kg/666.7 m2，而且此时其产量相对最高，达到487 kg/666.7 m2，各产量指数也达到相应最大.综上所述5齡宁夏枸杞适于甜菜碱及代谢相关酶及产量最佳的氮肥施用量为30 kg/666.7 m2.