铁皮石斛化学成分及其抗氧化活性研究

耿文慧，卢绍基，明艳林*

(1.厦门塔斯曼生物工程有限公司，福建 厦门 361000；2.福建省亚热带植物研究所/ 福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建 厦门 361006)

铁皮石斛(Dendrobium officinale) 为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)植物，主要分布在我国西南、华南及华东地区，是我国药用石斛的主要品种之一[1]。在我国传统医学中，铁皮石斛的干燥茎具有益胃生津、滋阴清热等作用，是一味名贵的中药材[2—3]。铁皮石斛花、叶具有滋阴润燥、理气安神等功效，是调理身体的养生佳品[4—5]。

研究发现，铁皮石斛花、叶、茎中成分不同，功效亦有差别。茎中主要有多糖[6]、糖苷类[7]、氨基酸[7]等成分，其中多糖含量可达31.9%[8]。花、叶富含多糖[9]、黄酮[10]、氨基酸[11]等，其中黄酮在花中可达2.31%[12]。铁皮石斛花、叶、茎均具有抗氧化、降血糖、增强免疫等功效[13—16]，但不同部位的功效对比鲜有报道。本文通过对铁皮石斛多糖、生物碱、黄酮等化学成分的测定，以及水提物、醇提物抗氧化活性研究，比较铁皮石斛不同部位的活性成分含量及提取物的抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

4 年生铁皮石斛的花、茎、叶干燥品由厦门塔斯曼生物工程有限公司提供，采摘时间为2019 年6～7 月。样品粉碎过40 目筛备用。

主要试剂：葡萄糖、Vc、芦丁(标准品，国药集团化学试剂有限公司)；DPPH、ABTS(分析纯，美国Sigma-Aldrich 公司)；苯酚、邻苯二氢钾、氢氧化钠、溴甲酚绿、对氨基苯磺酸(分析纯，西陇化工股份有限公司)；过硫酸钾、氯仿、无水乙醇、硫酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

主要仪器：电热恒温鼓风干燥箱(型号DHG-9075A，上海一恒科技有限公司)；三用恒温水箱(型号AH-W600，金坛市医疗仪器厂)；旋转蒸发仪(型号2100，东京EYELA 理化器械株式会所)；循环水式真空泵(型号SHB-II，郑州长城科工贸有限公司)；真空冷冻干燥机(型号A 联培ha-4LDplus，德国Christ 公司)；三用紫外分析仪(型号ZF-20D，上海越众仪器设备有限公司)。

1.2 多糖含量测定

1.2.1 标准曲线制备

取干燥至恒重的葡萄糖10 mg，定容至100 mL。取对照品溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL,分别置于5 mL 离心管中，各加水补至1.0 mL，加入5%苯酚溶液0.5 mL(现用现配)，再加硫酸2.5 mL，避光30 min。以蒸馏水为空白。按照紫外–可见分光光度法，在490 nm 波长处测定吸光度。标准曲线方程为y=11.691x+0.052，R2=0.9996。

1.2.2 样品制备

分别称取恒温干燥的铁皮石斛花、叶、茎1 g，将料液比为1:30 的样品首先利用超声破壁30 min，超声温度50 ℃，水浴90 min。将样液与95%乙醇按1:4 比例混合，摇匀，置于4 ℃过夜，离心，将沉淀物挥发乙醇后稀释10 倍备用。将铁皮石斛花、叶、茎沉淀物样液分别稀释，按照1.2.1 测定多糖含量。

1.3 总黄酮含量测定

1.3.1 标准曲线制备

称取芦丁2 mg，用95%乙醇定容至10 mL。取芦丁标准溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL 于5 mL 离心管，加95%乙醇定容至2 mL。加5% AlCl3乙醇(95%)溶液2.00 mL。室温孵育10 min。用紫外分光光度计于415 nm 波长处测定吸光度值。以95%乙醇溶液为空白。标准曲线方程：y=11.296x+0.005，R2=0.9998。

1.3.2 样品制备

分别称取铁皮石斛花、叶、茎1 g，按照料液比1:30 加入80%乙醇30 mL，50 ℃水浴提取2 h。取样液离心、稀释，按照1.3.1 测定铁皮石斛黄酮含量。样品的吸光度值记为B1。以95%乙醇代替AlCl3溶液制备本底，记为B2。按照标准曲线方程计算总黄酮含量。

1.4 生物碱含量测定

1.4.1 标准曲线制备

称取石斛碱1.0 mg，定容至100 mL。分别吸取石斛碱标准溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，加氯仿至10.0 mL。加入缓冲溶液(pH 4.5) 5.0 mL 和0.04%溴甲酚绿溶液(加pH 4.5 缓冲溶液溶解，过滤)1.0 mL，剧烈振摇3 min，静置30 min，用氯仿浸泡处理并用干燥的脱脂棉过滤，取滤液6.0 mL，加0.01 mol·L-1NaOH 无水乙醇溶液1.0 mL，摇匀。以氯仿为空白对照。于波长620 nm 处测定吸光度。标准曲线方程为y=0.0506x+0.1057，R²=0.9938。

1.4.2 样品制备

取铁皮石斛花、叶、茎各500 mg，于离心管中用适量氨水浸湿密闭30 min，加10 mL 氯仿，60 ℃水浴2 h，补氯仿至原重。吸取铁皮石斛花、叶、茎样液1 mL，稀释至100 mL，取10 mL 按照1.4.1 测定石斛碱含量。

1.5 抗氧化活性测定

1.5.1 水/醇提取物制备

分别称取铁皮石斛花、叶、茎50 g，按料液比1:30 加入蒸馏水或95%乙醇，45 ℃水浴提取12 h。提取液离心、抽滤，滤液真空浓缩干燥。

1.5.2 DPPH 自由基清除能力测定

取0.2 mmol·L-1DPPH 乙醇试剂2 mL，置于5 mL 离心管中加入梯度浓度的水提物、醇提物溶液2 mL。静置 30 min，在517 nm 下检测吸光度值，记为 AS；以95%乙醇代替DPPH 溶液为本底，记为A1；以95%乙醇代替样品为空白对照，记为A2。以抗坏血酸为阳性对照。不同梯度浓度样品的DPPH自由基清除能力按下式计算：DPPH 清除率K(%)=[1-(AS-A1)/A2]×100%。

1.5.3 ABTS 自由基清除能力测定

将1.4 mmol·L-1ABTS 水溶液与0.49 mmol·L-1过硫酸钾等体积混合后，稀释至原来4 倍，记为AB液。取2 mL AB 液置于5 mL 离心管中，加入梯度浓度样品2 mL。静置6 min，在734 nm 下检测其吸光度值，记为 AS′；以蒸馏水代替ABTS 溶液为本底，记为A1′；以蒸馏水代替样液为空白对照，记为A2′；以抗坏血酸为阳性对照。ABTS 清除率K′(%)=[1-(AS′-A1′)/A2′]×100%。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛不同部位化学成分含量

铁皮石斛不同部位的成分含量差异较大，多糖在铁皮石斛中的分布情况为：茎>叶>花；黄酮在铁皮石斛中的分布情况为：花>叶>茎；生物碱在铁皮石斛中含量均低于0.01%(表1)。多糖为铁皮石斛的标志性成分，在茎中的含量最高为23.92%；而黄酮在花中含量最高，为1.847%。

表1 铁皮石斛不同部位化学成分含量(%)Table 1 Content of chemical constituents in different parts of Dendrobium officinale (%)

2.2 铁皮石斛不同部位水/醇提取物的抗氧化活性

2.2.1 DPPH 自由基清除能力

比较铁皮石斛花、叶、茎的水提物和乙醇提取物与Vc的DPPH 自由基清除能力。结果表明，花水提物清除能力最强，其次为茎醇提物、花醇提物，铁皮石斛花的水提物和醇提物均表现出较强的DPPH 自由基清除能力(图1)，可能与花中较高的黄酮含量有关。DPPH 自由基清除能力大小依次为铁皮石斛花水提物>茎醇提物>花醇提物>叶醇提物>叶水提物>茎水提物，EC50分别为：410.4 μg·mL-1、454.1 μg·mL-1、573.2 μg·mL-1、576.3 μg·mL-1、1049 μg·mL-1、1767 μg·mL-1。

图1 铁皮石斛不同部位提取物对DPPH 自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity of extracts from different parts of Dendrobium officinale

2.2.2 ABTS 自由基清除能力

比较铁皮石斛花、叶、茎的水提物和乙醇提取物与Vc的ABTS 自由基清除能力。结果表明，茎的醇提物清除能力最强，其次为花水提物和醇提物。石斛花的水提物和醇提物均表现出较强的ABTS 自由基清除能力。铁皮石斛ABTS 自由基清除能力大小依次为：茎醇提物>花醇提物>花水提物>叶醇提物>茎水提物>叶水提物，EC50分别为61.1 μg·mL-1、62.2 μg·mL-1、103.0 μg·mL-1、157.8 μg·mL-1、427.1 μg·mL-1、464.8 μg·mL-1(图2)。与DPPH 相比，各组铁皮石斛水提物对ABTS 的清除能力较强，表明ABTS 清除实验可以作为测定水溶性物质抗氧化能力的指标。

图2 铁皮石斛不同部位提取物对ABTS 自由基的清除能力Fig.2 ABTS radical scavenging capacity of extracts from different parts of Dendrobium officinale

表2 铁皮石斛提取物自由基清除能力Table 2 Radical scavenging capacity of Dendrobium officinale

3 结论

石斛属中的“药用石斛”为本属国产种类中具细茎而花小的类群，包括铁皮石斛、霍山石斛(D.huoshanense)、金钗石斛(D.nobile)等[1]，其中铁皮石斛知名度较高[2]。张志信等[17]比较铁皮石斛花、叶、茎的化学成分含量，发现茎的多糖含量最高，叶的黄酮类物质含量最高，生物碱含量在各部位差异不显著。

本研究比较铁皮石斛花、叶、茎中主要成分以及石斛水提取物和乙醇提取物的体外抗氧化活性。结果表明，铁皮石斛茎多糖含量较高，可达23.92%，花中黄酮含量较高，可达1.85%，而生物碱在铁皮石斛各个部位均较少，在茎中含量仅为0.0086%，可能与石斛品种有关。在抗氧化活性上，铁皮石斛不同部位提取物对DPPH 自由基清除能力大小依次为：花水提物>茎醇提物>花醇提物>叶醇提物>叶水提物>茎水提物，EC50分别为 410.4 μg·mL-1、454.1 μg·mL-1、573.2 μg·mL-1、576.3 μg·mL-1、1049 μg·mL-1、1767 μg·mL-1；对ABTS 自由基清除能力大小依次为：茎醇提物>花醇提物>花水提物>叶醇提物>茎水提物>叶水提物，EC50分别为61.1 μg·mL-1、62.2 μg·mL-1、103 μg·mL-1、157.8 μg·mL-1、427.1 μg·mL-1、464.8 μg·mL-1。其中铁皮石斛茎醇提物表现出较强的抗氧化活性，但铁皮石斛花的抗氧化活性整体优于叶和茎。