闽产鹿角草中总黄酮与木犀草素含量分析
2020-04-14黄巧婷陈舒婷黄益海刘小芬
黄巧婷，陈舒婷，黄益海，刘小芬
(福建中医药大学药学院，福建 福州 350122)
鹿角草(Glossocardia bidens)为菊科(Compositae)鹿角草属(Glossocardia)多年生草本植物[1—3]。产我国广东、广西、海南岛、福建沿海和台湾，生于坚硬砂土、空旷沙地和海边，在福建沿海主要生长于丘陵砂质阳坡、花岗岩石缝等。中国大陆地区现代本草多有鹿角草药用记载[4—17]，其全草入药，称为香茹、金锁匙等，具清热利湿、解毒消肿、活血止血、镇咳化痰等功效。台湾产鹿角草含有黄酮类如木犀草素(luteolin)、木犀草素-7-葡萄糖苷(luteolin-7-glucoside)，倍半萜类如去氢木香内脂、二氢去氢木香内脂，三萜类如齐墩果酸，苯内素类如鹿角草素(glossogin)等有效活性成分；鹿角草乙醇提取物具抗炎、抗氧化、抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖、保肝、免疫调节、抑制破骨细胞形成等药理作用，主要活性成分为木犀草素和木犀草素-7-葡萄糖苷[18—27]。作者在第四次全国中药资源普查过程中，收集福建省不同地区的野生鹿角草样品，初步测定分析总黄酮与木犀草素含量，同时与市售品进行比较，以期为闽产野生鹿角草合理开发利用提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 野生鹿角草样品来源
在福建省中药资源普查过程中，收集东山县、惠安县、平潭岛、泉港区等地野生鹿角草资源，共得样品13 批，采集信息见表1。
表1 闽产野生鹿角草采集地信息Table 1 Information of wild Glossocardia bidens collected in Fujian
1.1.2 市售鹿角草药材来源
项目组在全国包括安徽、浙江等21 省市33 个购买点(中药材市场、药店、草药摊等)，购得不同产地鹿角草药材6 批，由福建中医药大学药学院刘小芬副教授鉴定，其中4 批为菊科鹿角草(Glossocardia bidens)来源，另2 批来源不确定。来源信息详见表2。
表2 市售鹿角草样品信息Table 2 Sample information of Glossocardia herba from markets
1.1.3 仪器与试剂
岛津LC-20AT 高效液相色谱分析仪(日本岛津公司)，PLATISIL ODS 高效液相色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)(迪马科技有限公司)，UV-9600 紫外分光光度计(常州国华电器有限公司)，芦丁对照品(HPLC≥98%，CAS#153-18-4，批号Y01M7S10307，上海源叶生物科技有限公司)，木犀草素对照品(HPLC≥98%，CAS#491-70-3，批号Y01D6S6815，上海源叶生物科技有限公司)，色谱甲醇(默克股份有限公司)，无水乙醇(AR，西陇科学股份有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 鹿角草供试品样液制备
样品阴干，粉碎，过4 号筛，备用。取样品粉末2.00 g，加50 mL石油醚(60～90 ℃)。超声20 min，过滤，弃除石油醚，药渣挥干。药渣加乙醇30 mL，超声提取，温度60 ℃、超声波功率600 W，提取30 min，提取3 次，合并滤液，定容至100 mL。
1.2.2 总黄酮含量测定
1.2.2.1 芦丁标准曲线制备
精密称量5.20 mg 干燥至恒重的芦丁对照品，加乙醇定容至50.0 mL，得芦丁对照品溶液，浓度为0.104 mg·mL-1。
吸取芦丁对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，各加乙醇至5.0 mL 后，加5% NaNO20.3 mL，摇匀，放置6 min；加10% Al(NO3)30.3 mL，摇匀，放置6 min；加1 mol·L-1NaOH 4 mL，加乙醇0.4 mL，摇匀，放置15 min。利用紫外分光光度法，于510 nm 处测吸光度(A)值，以空白为对照，得标准曲线回归方程y=7.7198x+0.0036，R2=0.999，线性范围0～0.052 mg·mL-1。
1.2.2.2 含量测定
取各供试品样液1.0 mL，按芦丁标准曲线方法测定，参照标准曲线，按公式1：X=BV1V2/M 计算总黄酮含量。式中，X 为含量(mg·g-1)，B 为测试液浓度(mg·mL-1)，V1为供试液定容体积100 mL，V2为测试液体积10 mL，M 为称样量2 g。
1.2.3 木犀草素含量测定
1.2.3.1 色谱条件
PLATISIL ODS 高效液相色谱柱(4.6 mm ×250 mm,5 μm)；流动相甲醇 :0.01%磷酸(40 :60)；流速1.0 mL·min-1，检测波长365 nm，进样量10.0 μL，柱温30 ℃。木犀草素保留时间约为39 min(图1)。
图1 木犀草素HPLC 色谱Fig.1 HPLC chromatogram of luteolin
1.2.3.2 线性关系
取木犀草素对照品5.00 mg，色谱甲醇超声溶解，定容至25.0 mL。分别吸取0.4、0.8、1.4、1.6、2.0、2.4 μL 木犀草素对照品溶液进样，以含量为自变量(x)，峰面积为因变量(y)，得标准曲线回归方程y=492990x–7223.1，R2=0.9999，线性范围0.08～0.48 μg·mL-1。
1.2.3.3 方法学考察
(1)精密度试验：取同一批药材，按1.2.1 项方法制备样品溶液，按1.2.3.1 项色谱条件连续进样5 次，仪器精密度良好，RSD=1.7%。
(2)重复性试验：取同一样品液3 份，按上述色谱条件分别进样，试验重复性良好，RSD=1.3%。
(3)稳定性试验：取0.88 μg·mL-1对照品溶液，每隔1 h 进样1 次，共进样5 次，峰面积积分值的RSD=1.7%。
(4)加样回收率试验：取同批样品5 份，分别加入对照品木犀草素，木犀草素平均回收率为97.94%。
1.2.3.4 含量测定
按照1.2.3.1 项下色谱条件测定样品，并将所得峰面积代入标准曲线，根据公式2：X=BMV1/V2×10-3计算各样品木犀草素含量(mg·g-1)。式中，X 为含量(mg·g-1)，B 为进样木犀草素含量(μg·10μL-1)，V1为供试液定容体积25 mL，V2为进样量10 μL，M 为称样量(g)。
2 结果与分析
2.1 总黄酮含量
17 批来源明确的样品总黄酮含量平均为32.879 mg·g-1。其中自采样品平均含量为33.900 mg·g-1，含量前三位的分别为采自惠安县安固村(50.986 mg·g-1)、浮山村(42.242 mg·g-1)、后曾村(41.076 mg·g-1)样品；含量最低的为采自惠安县南山村样品(18.096 mg·g-1)(图3)。4 批来源确定的市售品总黄酮含量平均为29.567 mg·g-1，最高37.967 mg·g-1，最低20.493 mg·g-1。2 批非鹿角草来源药材，其中购自安徽的样品总黄酮含量为1.775 mg·g-1，含量甚微，为19 批样品中最低者(图2)。
2.2 木犀草素含量
17 批来源明确的样品木犀草素平均含量3.695 mg·g-1。其中自采样品平均含量为3.026 mg·g-1，含量前三位的分别为采自东山县澳角村(9.720 mg·g-1)、惠安县安固村(9.071 mg·g-1)、东山县冬古村(5.198 mg·g-1)的样品；含量最低为采自惠安县南山村样品(0.839 mg·g-1)；样品最高含量为最低含量的11 倍(图3)。4 批来源确定的市售品平均含量为5.868 mg·g-1，最高12.500 mg·g-1，最低0.473 mg·g-1(图2)。2 批非鹿角草来源药材，其中购自浙江的样品木犀草素含量0.548 mg·g-1，安徽样品则未检测到木犀草素。
3 讨论
3.1 鹿角草资源与药材现状
图2 闽产鹿角草中总黄酮与木犀草素含量Fig.2 Total flavonoids and luteolin contents of Glossocardia bidens in Fujian
实验中17 批来源明确的鹿角草样品，13 份为自采福建野生样品，4 份为东山县市售野生药材。在东山县外的31 个购买批次中只购得2 批，且均非鹿角草来源；特别是购自安徽样品，其总黄酮与木犀草素含量甚微或无，其来源与用法均似与鹿角草无关，有待进一步回购研究。从现有分布与药材现状来看，鹿角草目前主要为区域性草药，特别为海峡两岸闽南地区与台湾地区的常用草药，其在我国两广地区、闽台地区的野生种质资源分布、资源丰富度与民间药用等方面有待进一步调查。
3.2 不同产地鹿角草总黄酮与木犀草素含量比较
鹿角草全草中最高含有总黄酮约5.10%，木犀草素含量最高1.25%，具有较高的药用价值。本次实验中共17 批来源明确的样品，其中东山产样品6批，总黄酮与木犀草素平均含量分别为2.75%、0.064%；惠安产样品9 批，总黄酮与木犀草素平均含量分别为3.63%、0.022%；泉港与平潭产2 批样品总黄酮含量居中，木犀草素含量较东山与惠安产的低。同时，单一样品中总黄酮与木犀草素含量无明显相关性。在17 批来源明确的样品中，仅样品3(惠安县安固村)的总黄酮含量(5.10%)与木犀草素含量(0.091%)均较高，可在资源保护的基础上，进一步合理开发利用。
3.3 鹿角草中木犀草素HPLC 色谱条件
本实验测定鹿角草木犀草素含量的HPLC 色谱条件，确定洗脱剂为甲醇 :0.01%磷酸=40 :60，流速1.0 mL·min-1，检测波长365 nm，柱温30 ℃，洗脱时间60 min。此色谱条件下样品中木犀草素分离度1 以上，理论塔板数为50000 以上。方法重现性高，操作性强，适合鹿角草木犀草素测定分析。
3.4 闽产鹿角草独特药用与研究建议
鹿角草在闽台地区的传统药用记载基本一致，主要用于清热解毒。但在闽南东山岛，民间以鹿角草炖红蟳治小儿食欲不振的用法颇为独特。在当地鹿角草此用法已有数十年历史，具有明确的食疗功效，是当地知名的小儿食疗单方，但此民间用法的物质基础研究尚属空白。因此，在跟踪、求证这一民间临床用药的基础上，明确其药效基础，具有进一步探讨的意义。
