组织蛋白酶Cathepsin B 对喉癌细胞侵袭转移的影响

陈立伟，翟性友，黄邦清，刘宸箐，张永侠，赵建东，刘明波

1解放军总医院海南医院 耳鼻咽喉头颈外科，海南三亚 572013；2 解放军总医院第一医学中心 耳鼻咽喉头颈外科，北京 100853

喉癌是最常见的呼吸道肿瘤之一，过去几十年中，喉癌的治疗取得了较大的进展，虽然手术治疗依然是喉癌治疗的主要手段，但放疗及全身综合治疗也渐成为喉癌治疗的方式之一[1]。因此，寻找调节喉癌侵袭、转移的关键调节因子，成为喉癌基础研究的重点之一。肿瘤的侵袭转移离不开侵袭前缘细胞外基质广泛的蛋白水解作用。基底膜的破坏和细胞外基质的降解被认为是肿瘤得以发生转移的关键环节，这个过程离不开许多蛋白水解酶的分泌和表达，这些蛋白降解酶使基底膜产生局部缺损，为肿瘤细胞的移动形成通道[2]。根据酶催化的底物和pH 不同，蛋白降解酶可分为丝氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶四大类。各种蛋白降解酶具有与肿瘤相关的多种生物学功能，在肿瘤的启动、侵袭、血管生成及转移等过程中发挥一定作用。组织蛋白酶(Cathepsin)是存在于溶酶体的细胞内半胱氨酸蛋白酶，在蛋白的降解和加工中发挥重要作用，与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移密切相关[3]。正常情况，组织蛋白酶与其内源性抑制剂含量保持平衡，在肿瘤中，组织蛋白酶与其抑制剂平衡被破坏，导致组织蛋白酶表达量或活性增高，促进肿瘤的发生、发展[4-7]。我们前期研究中发现无论在喉癌组织还是患者血清中，组织蛋白酶Cathepsin B 含量均显著高于正常对照组，提示Cathepsin B 在喉癌发生、发展中可能起到关键作用[8-9]。本研究通过体外试验，应用Cathepsin B 特异性抑制剂CA-074Me 处理喉癌Hep-2 喉癌细胞后，分析喉癌细胞活性的变化，从而推测Cathepsin B 在喉癌发生发展中的作用。

材料和方法

1 细胞培养及处理 喉癌Hep-2 细胞购自北京协和医学院基础医学研究所，在含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM 培养基中于37℃、5% CO2培养箱中培养。待60 mm 培养皿中Hep-2 细胞融合度达70%时，应用环氧酶琥珀酰肽甲基酯CA-074Me 按10μmol/L 的浓度处理细胞12 h、24 h(实验组)。对照组为正常培养Hep-2 细胞，不加CA-074Me 处理。

2 Western blot 蛋白检测实验 CA-074Me 处理细胞12 h、24 h 后，分别收集实验组和对照组肿瘤细胞，提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝法定量后按每孔80 mg 上样电泳，12%分离胶，120 V 电泳2.5 h后，在100 V、1.5 h 条件下将蛋白转移到NC 膜上，膜用10%脱脂奶粉TBST 溶液4℃封闭过夜，Cathepsin B 兔多克隆抗体(Abcam Hong Kong Ltd，1 ∶1 ∶250 稀释)37℃孵育1 h，TBST 洗3 遍后用HRP 标记的二抗1 ∶4 000 稀释与膜孵育40 min，再洗3 遍后，用超敏发光液(ECL)发光检测蛋白表达水平的变化。

3 Transwell 细胞侵袭和迁移实验 细胞侵袭实验：用Matrigel(Becton Dickinson and Company，1 mg/ml)胶包被Transwell 小室(Corning Incorporation 孔径8mm)，放于24 孔板中，将溶解于100 ml DMEM培养基中约1×105个细胞培养于小室上层，小室下层加入1 ml 含10%胎牛血清的DMEM 培养基。培养48 h 后，取出Transwell 小室，用蘸有PBS 的棉签擦去小室上层的细胞，取下Transwell膜，75%甲醇固定细胞30 min 后，0.1%结晶紫染色15 min，清水洗净，放在载破片上，盖上盖玻片，显微镜下随机选取5 个视野照相、计数穿过滤膜细胞。细胞迁移实验步骤同侵袭实验，区别是Transwell小室不铺Matrigel胶，接种细胞数减半，培养12 h 后染色计数。实验组及对照组均每组接种5 孔。

4 MTT 细胞增殖实验 实验组在接种前应用10μmol/L 的CA074Me 处理Hep-2 细胞24 h。收集细胞，然后按103/孔密度接种细胞于96 孔板中，在含10%胎牛血清的DMEM 培养基中培养，分别于第1、2、3、4、5、6、7 天加入20 μl MTT(5 mg/ml Sigma-Aldrich Corp)，继续培养4 h 后，加入150 ml DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，490 nm 酶联免疫检测仪检测各孔光吸收值。以时间为横轴，光吸收值为纵轴，绘制细胞增殖曲线。对照组为正常培养Hep-2 细胞。

5 统计学分析 采用Stata 软件进行统计分析。观测数据均为计量资料，以±s 表示，两组间比较用t 检验，三组间比较用单因素方差分析+多重比较LSD-t 检验，依时间变化数据组间比较采用重复测量方差分析。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 CA-074Me 抑 制Hep-2 细 胞Cathepsin B 蛋 白表达 应用CA-074Me 按10 mmol/L 的浓度处理Hep-2 细胞12 h 后，Western blot 试验检测Hep-2细胞Cathepsin B 蛋白表达水平出现明显降低，处理24 h 后，Cathepsin B 蛋白表达的降低更加显著，达到抑制其表达、进行功能研究的目的。见图1。

2 CA-074Me 抑制Hep-2 细胞侵袭、迁移能力 CA-074Me 处理24 h Hep-2 细胞后，Cathepsin B 蛋白表达被抑制，此时，Transwell 试验显示，Hep-2细胞降解Matrigel 胶穿过Transwell 小室的侵袭能力显著低于对照组：34.8±4.6/field vs 83.6±4.5/field (P ＜0.01)。Hep-2 细胞穿过Transwell 小室的迁移能力也显著降低：33.4±3.8/field vs 82.0±4.2/field (P ＜0.01)。见图2。

3 CA-074Me 抑制Hep-2 细胞增殖能力 将Hep-2 细胞和CA-074Me 处理24 h 后的Hep-2 细胞连续培养7 d，经重复测量方差分析发现CA-074Me 处理后的Hep-2 细胞增殖能力从第3 天开始显著低于对照组，说明抑制了Cathepsin B 蛋白表达后，喉癌细胞的增殖能力被显著抑制。见图3。

图 1 Western blot检测Hep-2细胞中Cathepsin B水平。 Hep-2:正常培养Hep-2细胞; Hep-2-CA-074Me(12 h): CA-074Me处理Hep-2细胞12 h；Hep-2-CA-074Me(24 h): CA-074Me处理Hep-2细胞24 h； aP ＜0.01Fig. 1 Western blot was used to detect the level of cathepsinB in Hep-2 cells. Hep-2: Hep-2 cells were cultured normally; Hep-2-CA-074Me (12 h): CA-074Me Hep-2 cells were treated with CA-074Me for 12 hours; CA-074Me (24 h): Hep-2 cells were treated with Hep-2-CA-074Me for 24 hours. aP ＜0.01

讨 论

图 3 MTT试验Hep-2细胞增殖能力检测(Hep-2:正常培养Hep-2细胞; Hep-2-CA-074Me：CA-074Me处理Hep-2细胞； aP ＜0.01)Fig. 3 MTT assay was used to detect the proliferation of Hep-2 cells (Hep-2: Hep-2 cells cultured normally; Hep-2-CA-074Me: Hep-2 cells were treated with CA-074Me； aP ＜0.01)

头颈鳞癌是全球范围内第六大常见肿瘤[10]。早期发现治疗效果较好，晚期患者治疗效果欠佳。据报道，T1、T2 期的喉癌治愈率达80% ～ 90%，而临床Ⅳ期喉癌患者，5 年生存率仅约40%，2/3患者确诊时已为晚期[11-12]。95%的原发性喉癌为鳞状细胞癌。近年来无论国内外报道，喉癌的治疗效果均没有明显提高，因此寻找调控喉癌发生发展的关键因子，有利于探索喉癌的分子靶向治疗。

组织蛋白酶Cathepsin B 是存在于溶酶体内的一种蛋白酶，在溶酶体的酸性环境下进行自催化活化，形成活性组织蛋白酶。在肿瘤发生发展中，Cathepsin B 与细胞增殖、血管生成、炎症、侵袭、转移及细胞凋亡相关[13]。文献报道其高表达与乳腺癌、黑色素瘤、结直肠癌等多种肿瘤密切相关[5,14-17]。Cathepsin B 在肿瘤组织中活性增加，既是由于Cathepsin B 内在表达的增加，又与内源性低分子量的半胱氨酸蛋白酶抑制剂调控下降相关。组织蛋白酶的抑制物大致包括Stefin A(Cystatin A)、Cystatin C 和Kininogens。抑制Cathepsin B 后能降低其对胶原蛋白的降解能力，抑制肿瘤细胞转移能力[18-19]。既然Cathepsin B 在肿瘤的侵袭、转移中起到重要作用，那么对于晚期肿瘤，Cathepsin B 的特异性抑制剂对于肿瘤意义更大。研究发现，在具有自发性骨转移乳腺癌的免疫活性模型中，腹膜内施用高选择性Cathepsin B 抑制剂CA-074，而不是广谱半胱氨酸组织蛋白酶抑制剂JPMOEt，减少了肿瘤的转移[20]。本研究中，我们应用Cathepsin B 选择性抑制剂CA-074Me 体外处理喉癌Hep-2 细胞24 h，Cathepsin B 的表达量显著下降后，Hep-2 细胞体外侵袭、迁移能力明显下降。体外增殖试验显示，Cathepsin B 低表达后肿瘤细胞体外增殖能力也显著降低。提示Cathepsin B 的过表达促进喉癌细胞的增殖，并且增强了肿瘤细胞的侵袭、转移能力。更加明确了Cathepsin B 基因在喉癌侵袭和转移中起到的重要作用。综上，Cathepsin B 在喉癌侵袭转移中起到重要作用，通过抑制其表达，有望降低喉癌患者肿瘤的侵袭和转移。Cathepsin B 或可成为喉癌治疗的新靶标。

Fig. 2 Transwell test was used to detect the invasive ability (A, B, C) and the migration ability (D, E, F) of Hep-2 cells (Hep-2: Hep-2 cells were cultured normally; Hep-2-CA-074Me：Hep-2 cells were treted with CA-074Me; aP ＜0.01)