HPLC-ELSD全成分指纹图谱研究疏肝理脾方配伍前后化学成分的变化

黄 湘，陈丰连，曹 骋，王术玲

(广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006)

根据中医五行理论，肝郁气滞，疏泄失常，致令运化失司，是为“木郁戕土”；脾虚失运，化源不充，肝失所藏，血不养肝，亦每令疏泄失常，是为“土虚木郁”，皆肝脾不和之证[1]，遂有四逆散、柴胡疏肝散、逍遥散等调和肝脾之经典方药。其中柴胡疏肝散出自《景岳全书·古方八阵·散阵》，由柴胡、陈皮、枳壳、香附、芍药、川芎、甘草七味药组成。方中柴胡为君药，配伍陈皮、枳壳，起到行气解郁导滞、疏肝理脾的作用，临床常用于肝气郁结导致的胁肋疼痛等症状[2]，也用于抑郁症[3]、功能性消化不良[4]、脂肪肝[5]等疾病。本研究团队根据柴胡疏肝散的配伍规律，自拟疏肝理脾方，由柴胡、陈皮、枳壳三味药组成，研究其治疗功能性消化不良，取得较好效果，并且发现单用疏肝药柴胡或单用理气药陈皮、枳壳药理效果均不如三者合用。因此，作者利用HPLC-ELSD全成分指纹图谱研究三者配伍前后化学成分的变化，为后续药效物质基础研究提供数据支撑。

1 实验

1.1 药品、试剂与仪器

柴胡饮片(产地陕西)；麸炒枳壳饮片(产地江西，生产批号为HX18M01)，广东和翔制药有限公司；陈皮饮片(产地广东，生产批号为170301)，佛山星联中药饮片有限公司。

柴胡皂苷a、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品(批号分别为P03M9F50593、K21F3C1、M02J9S64781、Z31J6L2067，纯度均≥98%)，上海源叶生物科技有限公司；柴胡皂苷b2(批号为MUST-15082505，纯度≥98%)，成都曼思特生物科技有限公司；超纯水，自制；乙腈，色谱纯；其它化学试剂均为分析纯。

Nexera X2型高效液相色谱仪，日本岛津公司；ELSD 6000型蒸发光散射检测器，美国奥泰科技有限公司；DE-200 g型万能粉碎机，浙江红景天工贸有限公司；实验室专用超纯水机，沃特浦；BP211D型电子分析天平，德国赛多利斯公司；TC-15型套式恒温器，海宁新华医疗器械厂。

1.2 方法

1.2.1 对照溶液的制备

取柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品适量，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别得2.520 mg·mL-1柚皮苷对照溶液、1.700 mg·mL-1橙皮苷对照溶液、1.545 mg·mL-1新橙皮苷对照溶液。分别精密量取上述对照溶液各2 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照溶液1。

取柴胡皂苷a对照品、柴胡皂苷b2对照品适量，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别得1.552 mg·mL-1柴胡皂苷a对照溶液、1.516 mg·mL-1柴胡皂苷b2对照溶液。分别精密量取上述对照溶液各1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照溶液2。

1.2.2 醋陈皮饮片的制备[6]

取陈皮饮片适量，按0.15 kg·kg-1加入米醋，拌匀，置于有盖容器中闷透，文火加热，炒至陈皮饮片内表面微黄色，取出晾凉，即得醋陈皮饮片。

1.2.3 疏肝理脾方水煎液的制备

取柴胡饮片、醋陈皮饮片、麸炒枳壳饮片，粉碎，过4号筛；称取3.00 g柴胡饮片粉末、3.00 g醋陈皮饮片粉末、2.25 g麸炒枳壳饮片粉末，置于250 mL回流瓶中，加水100 mL，浸泡15 min，加热回流30 min，过滤；滤液移至100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得疏肝理脾方水煎液。

1.2.4 柴胡单煎液的制备

称取柴胡饮片粉末(过4号筛)3.00 g，置于250 mL回流瓶中，加水 100 mL，浸泡15 min，加热回流30 min，过滤；滤液移至100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得柴胡单煎液。

1.2.5 陈皮枳壳合煎液的制备

分别称取醋陈皮饮片粉末(过4号筛)3.00 g、麸炒枳壳饮片粉末(过4号筛)2.25 g，置于250 mL回流瓶中，加水 100 mL，浸泡15 min，加热回流30 min，过滤；滤液移至100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得陈皮枳壳合煎液。

1.2.6 供试溶液的制备

分别精密量取上述水煎液各25 mL，上样至预处理好的D101大孔树脂柱(湿法装柱，高15 cm，内径1.5 cm)，先用200 mL 水冲洗，弃去水洗液；再用200 mL 55%乙醇洗脱，最后用200 mL 95%乙醇洗脱，分别收集，水浴蒸干，加甲醇使残渣溶解，分别转移至50 mL容量瓶、1 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，进样前过0.22 μm微孔滤膜。

1.2.7 色谱条件

Phenomenex Kinetex C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈(B)-水(A)为流动相进行梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，蒸发光散射检测器(ELSD)，氮气流速3.0 mL·min-1。洗脱梯度1:0～15 min，10%～20%B；15～24 min，20%～24%B；24～25 min，24%～10%B；洗脱梯度2:0～20 min，38%～40%B；20～30 min，40%～50%B；30～31 min，50%～38%B。

2 结果与讨论

2.1 指纹图谱的建立和分析

2.1.1 精密度实验

取同一份疏肝理脾方水煎液的55%乙醇洗脱部位和95%乙醇洗脱部位，分别按洗脱梯度1、洗脱梯度2的色谱条件连续进样6针，采集色谱峰数据，计算相似度。结果表明，RSD均小于2%，表明仪器的精密度良好。

2.1.2 稳定性实验

取同一份疏肝理脾方水煎液的55%乙醇洗脱部位和95%乙醇洗脱部位，分别按洗脱梯度1、洗脱梯度2的色谱条件每隔2 h进样，采集色谱峰数据，计算相似度，考察12 h内的稳定性。结果表明，RSD均小于2%，表明供试溶液室温放置12 h内稳定。

2.1.3 重复性实验

平行制备6份疏肝理脾方水煎液的55%乙醇洗脱部位和95%乙醇洗脱部位，分别按洗脱梯度1、洗脱梯度2的色谱条件进样，采集色谱峰数据，计算相似度。结果表明，RSD均小于3%，表明方法的重复性良好。

2.1.4 指纹图谱的建立

分别制备疏肝理脾方水煎液、柴胡单煎液、陈皮枳壳合煎液各10份，并按1.2.6方法分别制得55%乙醇洗脱部位和95%乙醇洗脱部位的供试溶液，分别按洗脱梯度1、洗脱梯度2的色谱条件进样，记录色谱图。将色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件，计算各批次间的相似度，均大于0.9，并得到共有模式图，见图1。

a陈皮枳壳合煎液55%乙醇洗脱部位 b.陈皮枳壳合煎液95%乙醇洗脱部位 c.柴胡单煎液95%乙醇洗脱部位

2.1.5 共有峰的确定与色谱峰归属分析

对指纹图谱中峰面积占总峰面积比例>1%的色谱峰进行指认，共指认26个共有峰，柴胡单煎液的95%乙醇洗脱部位共有指纹峰10个，陈皮枳壳合煎液的55%乙醇洗脱部位共有指纹峰4个、95%乙醇洗脱部位共有指纹峰19个，疏肝理脾方水煎液的55%乙醇洗脱部位共有指纹峰4个、95%乙醇洗脱部位共有指纹峰23个。通过与对照溶液比较，确认2号峰为柚皮苷(tR=20.23 min)，3号峰为橙皮苷(tR=21.06 min)，4号峰为新橙皮苷(tR=22.45 min)，12号峰为柴胡皂苷a(tR=18.74 min)，14号峰为柴胡皂苷b2(tR=19.19 min)。

将疏肝理脾方水煎液的指纹图谱分别与陈皮枳壳合煎液、柴胡单煎液的指纹图谱进行对比，可以看出：疏肝理脾方水煎液的55%乙醇洗脱部位4个色谱峰均来自陈皮、枳壳，依次为芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷，柴胡单煎液在此部位没有检出成分。疏肝理脾方水煎液的95%乙醇洗脱部位有5个色谱峰来自于柴胡，分别为8号峰、12号峰、14号峰、17号峰和18号峰；有15个色谱峰来自于陈皮、枳壳；另外，还有3个色谱峰为3种水煎液共有，说明三药配伍后没有生成新的化学物质。相反，有3个化学成分在配伍后检测不到，分别是柴胡单煎液中23号峰、24号峰，陈皮枳壳合煎液中的15号峰。疏肝理脾方化学成分的归属见表1。

2.2 样品中化学成分的含量测定

2.2.1 线性关系考察

精密吸取1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL混合对照溶液1，按洗脱梯度1的色谱条件分别进样，结果见图2a。精密吸取1 μL、2 μL、5 μL、8 μL、10 μL、12 μL混合对照溶液2，按洗脱梯度2的色谱条件分别进样，结果见图2b。以峰面积对数为纵坐标、进样质量对数为横坐标，绘制标准曲线，得到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的回归方程，分别为y=1.3384x+5.27887(R2=0.9973)、y=1.4778x+5.127(R2=0.9968)、y=1.4438x+5.2354(R2=0.9960)，线性范围依次为0.504～10.08 μg、0.34～6.8 μg、0.309～6.18 μg。得到柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的回归方程，分别为y=1.4207x+4.6519(R2=0.9975)、y=1.5649x+4.8164(R2=0.9978)，线性范围依次为0.1552～1.8624 μg、0.1516～1.8192 μg。

表1疏肝理析

Tab.1 Comparative analysis of fingerprints before and after compatibility of Shugan Lipi formula

图2 混合对照溶液1(a)和混合对照溶液2(b)的HPLC图谱Fig.2 HPLC spectra of mixed control solution 1(a) and mixed control solution 2(b)

2.2.2 精密度实验

取混合对照溶液，按1.2.7项下色谱条件梯度洗脱，连续进样6次，记录峰面积。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的峰面积的RSD分别为2%、1%、1%、2%、2%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性实验

按1.2.6方法制备供试溶液，每隔2 h进样，记录峰面积，考察12 h内的稳定性。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的峰面积的RSD分别为2%、2%、1%、2%、2%，表明供试溶液中待测成分常温下放置12 h稳定。

2.2.4 重复性实验

按1.2.6方法平行制备6批供试溶液，按1.2.7项下色谱条件梯度洗脱，进样，记录峰面积。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的平均含量分别为 888.5 μg·mL-1、504.0 μg·mL-1、562.0 μg·mL-1、7.3 μg·mL-1、4.5 μg·mL-1，RSD分别为3%、3%、2%、4%、5%，表示该方法重复性良好。

2.2.5 加样回收率实验

精密量取水煎液10 mL，按100%比例加入对照品，按1.2.6方法平行制备6批供试溶液，按1.2.7项下色谱条件梯度洗脱，进样，记录峰面积，计算回收率。结果表明，回收率分别为：柚皮苷95.6%(RSD=1%)，橙皮苷99.1%(RSD=3%)，新橙皮苷96.6%(RSD=1%)，柴胡皂苷a 97.8%(RSD=3%)，柴胡皂苷b298.6%(RSD=3%)。

2.2.6 样品测定

分别制备疏肝理脾方水煎液、柴胡单煎液、陈皮枳壳合煎液各10份，经大孔树脂净化得55%乙醇洗脱部位和95%乙醇洗脱部位，按1.2.7项下色谱条件梯度洗脱，分别进样10 μL、20 μL，记录峰面积，运用外标两点法计算化学成分含量，见表2。

表2 样品中5个化学成分的含量测定/(μg·mL-1，n=10)

Tab.2 Content determination of five chemical components in samples/(μg·mL-1，n=10)

2.3 讨论

本科研团队前期采用HPLC-UVD法建立了柴胡疏肝散的指纹图谱[7]，但因紫外检测器只识别有特征紫外吸收的化学成分，具有局限性，因此，本研究采用蒸发光散射检测器建立疏肝理脾方的全成分化学指纹图谱。另外，因为陈皮、枳壳均主要含黄酮类成分，并且含量远高于柴胡中的柴胡皂苷类，受检测器满量程的限制，只能把疏肝理脾方中成分分成两个洗脱部位分别检测，55%乙醇洗脱部位主要为含量较高的黄酮类，95%乙醇洗脱部位主要为柴胡皂苷类及黄酮苷元，均是含量较低的组分。

原方中陈皮为醋制，陈皮本身化痰止咳，醋炒后疏肝行气。枳壳为麸炒，后者的炮制方法在《中国药典》有详细的记载，但是陈皮的醋制只在《博济》中曾有过记载，推测因其药性与青皮对比较为缓和，在现代的炮制方法中只对青皮醋制做了记载，所以陈皮的炮制方法并无确定的方案，经咨询广州中医药大学炮制教研室的陈康教授后，决定采用2015年版《中国药典》中的醋炙方法制备醋陈皮饮片。

三药配伍后的HPLC图谱共有23个峰，其中5个峰来自于柴胡，15个峰来自于陈皮、枳壳合煎，3个峰为三者所共有，在三药配伍后并没有出现新的色谱峰，说明在三药配伍后并没有产生新的化学成分。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷三者含量均在三药配伍后减少，而柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的含量均在配伍后增加，说明柴胡配伍陈皮、枳壳后会使柴胡皂苷a和b2溶出率增加。那么疏肝理脾方的整体药效要比单煎液要好是否与柴胡皂苷的溶出率升高有关还有待更深入的研究。

3 结论

采用HPLC-ELSD研究疏肝药柴胡与理脾药陈皮、枳壳配伍前后主要化学成分的变化。色谱条件为：Phenomenex KinetexC18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) ，柱温30 ℃；以乙腈(B)-水(A)为流动相进行梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1；蒸发光散射检测器，氮气流速3.0 mL·min-1。所有样品溶液经大孔树脂净化处理，得55%乙醇洗脱部位和95%乙醇洗脱部位。对供试溶液分别建立指纹图谱，并测定其中柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的含量。结果表明，指纹图谱中共指认26个色谱峰，三药配伍后没有新的化学成分生成，但柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的含量减少，柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2含量显著升高。本研究建立了疏肝理脾方的HPLC-ELSD全成分指纹图谱，可以用于方中多个指标成分的同时测定。