HPLC法同时测定新疆唇香草总黄酮提取物中3种黄酮类成分的含量

马 昕，燕雪花，张建新，刘宏炳

(新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

唇香草(ZiziphoraclinopodioidesLam.)为唇形科新塔花属多年生半灌木草本植物，别名芳香新塔花、小叶薄荷、山薄荷等，全株有强烈的薄荷香气，喜生于低山坡、草地及干旱坡地上，是新疆的特有药材，主要分布于我国新疆的阿勒泰山、天山、准噶尔西部山地、帕米尔高原的山地草原及砾石质坡地，中亚的哈萨克斯坦、吉尔吉斯坦、蒙古亦有分布[1]。唇香草全株地上部分均可入药，其味辛性寒，具有强心利湿、理气化痰、消炎散结的功效，用于治疗心脏病、气短多汗、水肿、咳嗽、气管炎、肺脓肿等疾病，尤其在治疗心脏病和高血压疾病方面有很好的疗效[2]。现代药理研究表明，唇香草具有良好的抗心肌缺血缺氧作用[3-5]、舒张血管[6-8]、抗氧化[9-12]、抗炎、止咳、祛痰和镇痛作用[13]。唇香草含有挥发油、黄酮类、生物碱类、维生素、苷类、有机酸、微量元素等成分[14-15]。唇香草在新疆民间被广泛用于治疗高血压、冠心病和调节心血管系统功能，在中医临床上用于治疗高血压以及心肌缺血等疾病。本课题组前期研究表明，唇香草具有明显的抗动脉粥样活性，而总黄酮是其主要的有效成分。为了对唇香草及其总黄酮提取物进行质量控制，作者以木犀草苷、芦丁、芹菜苷等3个黄酮类成分为指标，建立同时测定其含量的HPLC法，拟用于唇香草总黄酮提取物有效成分的质量评价与控制，为其更深入的研究和资源的合理利用提供可靠的依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

唇香草总黄酮提取物，由新疆医科大学中医学院中心实验室提供。

木犀草苷对照品(批号：5373-11-5，含量>98%)、芹菜苷对照品(批号：Q-077-150720，含量>98%)，成都瑞芬思生物科技有限公司；芦丁对照品(批号：MUST-15091104，含量>98%)，中国科学院成都生物研究所；甲醇(色谱纯)；磷酸(分析纯)；其它试剂均为分析纯。

Agilent 1220 LC型高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；ME204E型分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；KQ-5200DE型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱为依利特Hypersil ODS-2(C18)(4.6 mm ×150 mm，5 μm) ；流动相为甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱：0～30 min，25%A；30～55 min，25%～28%A；55～75 min，28%～35%A；75～100 min，35%～38%A；检测波长为360 nm；柱温为35 ℃；流速为1 mL·min-1；进样量为10 μL。

1.2.2 对照溶液的配制

精密称取木犀草苷、芦丁、芹菜苷对照品适量，加甲醇分别配制成1.1 mg· mL-1木犀草苷对照溶液、1.1 mg·mL-1芦丁对照溶液、1.0 mg·mL-1芹菜苷对照溶液作为储备液，备用。

1.2.3 供试溶液的配制

精密称取唇香草总黄酮提取物约 0.017 5 g，置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇约 9 mL 超声(功率 200 W，频率 40 kHz) 溶解唇香草总黄酮提取物，冷却后用甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，滤液作为供试溶液，备用。

2 结果与讨论

2.1 线性关系考察

精密量取对照储备液适量，加甲醇分别制成4.4 μg·mL-1、8.8 μg·mL-1、17.6 μg·mL-1、26.4 μg·mL-1、35.2 μg·mL-1、44.0 μg·mL-1木犀草苷对照溶液，4.4 μg·mL-1、8.8 μg·mL-1、17.6 μg·mL-1、26.4 μg·mL-1、35.2 μg·mL-1、44.0 μg·mL-1芦丁对照溶液，4.0 μg·mL-1、8.0 μg·mL-1、16.0 μg·mL-1、24.0 μg·mL-1、32.0 μg·mL-1、40.0 μg·mL-1、60.0 μg·mL-1、80.0 μg·mL-1芹菜苷对照溶液。进样测定峰面积，以进样量(x)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线，拟合得线性回归方程，结果见表1。

表1 唇香草总黄酮提取物中3种黄酮类成分的线性回归方程

Tab.1 Linear regression equation of three flavonoids in totalflavonoid extracts ofZiziphoraclinopodioidesLam.

对照品回归方程R线性范围/μg木犀草苷y=364680.07x-153286.970.99984.4～44.0芦丁y=217812.29x+9326.031.00004.4～44.0芹菜苷y=203866.01x+173487.810.99984.0～80.0

2.2 精密度实验

取同一混合对照溶液，重复进样6次，进样量10 μL，计算得到木犀草苷、芦丁、芹菜苷峰面积的RSD 分别为1.68%、1.24%、 1.16%，表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性实验

精密吸取同一供试溶液10 μL，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样测定，计算得到木犀草苷、芦丁、芹菜苷峰面积的RSD分别为1.08%、1.27%、1.66%，表明供试溶液在24 h 内稳定。

2.4 重复性实验

精密称取6份同一批次唇香草总黄酮提取物约0.017 5 g，按1.2.3制备供试溶液 6 份，进样量10 μL，测定各组分峰面积，计算得到供试品中木犀草苷、芦丁、芹菜苷峰面积的RSD 分别为1.72%、1.55%、1.38%，表明该方法的重复性良好。

2.5 加标回收率实验

精密称取已知含量的唇香草总黄酮提取物0.017 5 g，分别精密加入一定量的对照品，按1.2.3平行制备9份供试溶液，进样测定，计算回收率，结果见表2。

表2加标回收率实验结果(n=9)

Tab.2 Result of adding standard recovery(n=9)

由表2可知，木犀草苷的平均加标回收率为99.99，RSD 为1.72%(n=9)；芦丁的平均加标回收率为99.12%，RSD为2.07%(n=9)；芹菜苷的平均加标回收率为99.74%，RSD为2.41%(n=9)。表明方法的准确度良好，回收率实验符合要求。

2.6 样品含量测定

精密称取不同批次唇香草总黄酮提取物0.017 5 g，按1.2.3制备供试溶液。分别精密吸取混合对照溶液及供试溶液10 μL，进样测定木犀草苷、芦丁、芹菜苷含量，结果见表3、图1。

表3 唇香草总黄酮提取物中3种黄酮类成分的含量测定

Tab.3 Determination of contents of three flavonoids in totalflavonoid extracts ofZiziphoraclinopodioidesLam.

样品批号木犀草苷mg·g-1芦丁mg·g-1芹菜苷mg·g-1201901052.674.598.02201903112.694.497.99201905062.684.548.06

1.木犀草苷 2.芦丁 3.芹菜苷

3 结论

结合唇香草总黄酮中的化学组成，建立了同时检测总黄酮提取物中指标性成分木犀草苷、芦丁、芹菜苷的HPLC法。结果表明，木犀草苷、芦丁、芹菜苷质量分别在4.4～44.0 μg(R=0.9998) 、4.4～44.0 μg(R=1.0000)、4.0～80.0 μg(R=0．9998)内与峰面积线性关系良好，平均加标回收率分别为99.99%、99.12%、99.74%，RSD分别 为1.72%、2.07%、2.41%。该方法专属性好、快速、准确，稳定、重复性好，可作为唇香草总黄酮中黄酮类成分的含量检测方法，为其质量评价与控制标准提供实验依据。