纳米氧化锌对玉米种子萌发及根系碳代谢的影响

孙露莹，宋凤斌，李向楠，朱先灿，刘胜群，王 洋，齐晓宁

(1．中国科学院 东北地理与农业生态研究所 黑土区农业生态重点实验室，吉林 长春 130102;2．中国科学院大学，北京 100049)

0 引 言

纳米氧化锌(ZnO nanoparticles，ZnO NPs)作为一种纳米金属氧化物，因其具有独特的物理性质和较大的比表面积，越来越多的应用在医药、农业等多领域的研究[1-2]。纳米材料的广泛应用增加了其释放到环境中的可能性，不可避免地通过影响植物不同阶段的生长发育，进而影响整个农业生态系统[3-4]。

种子萌发是植物生长周期的第一阶段，也是对非生物环境因子最敏感的时期之一。而纳米材料对植物种子萌发作用是积极的还是消极的，仍然没有统一的认识。有研究认为，小尺寸的纳米材料易于渗透和调节水通道，促进种子萌发；大的比表面积有助于吸附和输送更多的物质[5]。Lahiani等[6]的研究也证明了这一点，多壁碳纳米管(MWCNTs)通过调控编码玉米种皮上的几种水通道蛋白的基因表达，加强了种子对水分的吸收，刺激了种子发芽。锌作为植物生长所必须的营养元素，其氧化物的纳米颗粒对植物的影响更复杂。关于纳米氧化锌对白菜、番茄及黄瓜等种子萌发的促进作用已有较好的研究[7-8]。Mahajan等[9]研究发现，20 mg·L-1的ZnO NPs有利于绿豆种子的萌发，1 mg·L-1ZnO NPs可促进鹰嘴豆种子的萌发，高于该浓度时会抑制其萌发和生长。种子萌发过程中在其内部进行着复杂的生理生化变化，需要启动多条代谢途径，为种子萌发过程提供物质和能量，其萌发成功与否还取决于淀粉酶、蛋白酶等对贮藏物质的分解和利用。Laware和Raskar[10]研究发现，低浓度的纳米TiO2提高了蛋白酶和淀粉酶活性，促进种子萌发和幼苗生长。萌发后期，植物对水分和养分的吸收取决于根系的生长状况及根系形态。同时，植物根系构型易受外界环境及水肥条件等的影响。纳米材料对根系形态的研究也报道不一。有研究表明，低浓度(50～100 μg·mL-1)的碳纳米管促进了水稻根系的伸长，利于植株对养分的吸收，而高浓度(150 μg·mL-1)的碳纳米管则抑制了根系的活力和生长[11]。

然而，目前关于纳米氧化锌对玉米种子萌发和幼苗根系形态的影响研究较少，尤其是有关纳米氧化锌调控玉米幼苗根系碳代谢的了解甚少。本文通过设置不同浓度的纳米氧化锌，探究其对玉米种子的萌发及其萌发后期根系糖代谢调控的影响，从而筛选出促进种子萌发及幼苗建成最适的纳米氧化锌浓度。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 试验方法

种子表面消毒：选取大小一致、籽粒饱满的玉米种子，用1%的次氯酸钠溶液消毒30 min，再用超纯水冲洗5次，然后，用滤纸将水吸干。

浸种：将已消毒的100粒种子置于盛有处理液的三角瓶中，用封口膜封住瓶口，于28 ℃，200 r·min-1震荡12 h。

种子萌发试验：将浸种处理的30粒种子平铺于放有双层中速定性滤纸的培养皿上，放入22 ℃黑暗培养箱中发芽7 d，定期补充水分以确保滤纸湿润，每个处理3次重复。以胚根至少达种子长度1/2作为发芽标准，每24 h记录种子发芽情况。对种子萌发7 d的胚根、胚芽长度、鲜重和不定根数等生长数据进行定量分析[12]。计算各发芽指标。公式如下：

Vi=S×Gi

糖代谢关键酶活性的测定：0.5 g玉米根鲜样加少量PVPP于液氮中研磨，加入1 mL浸提缓冲液(200 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸/氢氧化钠(HEPES/NaOH)，pH 7.5；3 mM氯化镁(MgCl2)；1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)；2%丙三醇；0.1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF)；1 mM苯甲脒)。将匀浆置于冰上完全解冻后，4 ℃下20 000 g离心30 min，取上清液在4 ℃下20 000 g离心45 min，此上清液一部分用于测定醛缩酶(Aldolase)、磷酸果糖激酶(PFK)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)、磷酸葡糖异构酶(PGI)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)；另一部分冰上透析过夜，用于测定己糖激酶(HXK)；详细方法参考Jammer等[13]。

1.3 数据统计分析

采用Excel 2016整理数据，SPSS 22统计软件进行数据分析；所有数据先进行方差齐性检验，然后进行单因素方差分析(One-way ANOVA)(P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著)；使用Origin9.6软件制图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度ZnO NPs浸种前后处理液Zn2+浓度变化

浸种前，纳米氧化锌悬浮液随着浓度的增加逐渐呈白色，其Zn2+含量随着纳米氧化锌浓度升高呈先上升后下降的趋势，200 mg·L-1的纳米氧化锌悬浮液中Zn2+含量最高，高于此浓度的纳米氧化锌悬浮液中Zn2+含量趋于稳定(图1、2)。此外，对照组的Zn2+20 mg·L-1的水溶液中Zn2+含量最高，这表明纳米氧化锌的悬浮液中部分纳米氧化锌溶于水，以离子形态存在；当纳米氧化锌浓度高于500 mg·L-1时，绝大部分的纳米氧化锌颗粒形成了团聚体[14]。浸种后，处理液颜色都变浅，低于100 mg·L-1的纳米氧化锌悬浮液的Zn2+含量均低于浸种前；相反的是，高于100 mg·L-1的纳米氧化锌悬浮液的Zn2+含量却高于浸种前。Zn2+含量的降低表明，在浸种的过程中，种子吸水膨胀，有助于溶液中的Zn2+被种子吸收。而高浓度的纳米氧化锌悬浮液中的Zn2+含量却在浸种后增加，这可能与植物的存在有利于纳米氧化锌悬浮液中可溶性锌的含量增加有关[1]。

2.2 不同浓度ZnO NPs对玉米种子萌发的影响

低浓度(10 mg·L-1、20 mg·L-1和50 mg·L-1)ZnO NPs处理下，种子发芽率随着ZnO NPs浓度升高而升高；而高于50 mg·L-1的试验组随着ZnO NPs浓度升高而降低(图3)。试验组20～500 mg·L-1ZnO NPs处理的种子发芽率都高于无添加纳米氧化锌和20 mg·L-1Zn2+的对照组。特别是50 mg·L-1ZnO NPs的试验组的发芽率比无添加纳米氧化锌和20 mg·L-1Zn2+的对照组高11.3%和18.7%；同时也显著高于10 mg·L-1和1 000 mg·L-1的试验组(P<0.05)。1 000 mg·L-1ZnO NPs处理抑制了种子的萌发。

低浓度(10 mg·L-1、20 mg·L-1和50 mg·L-1)ZnO NPs处理下，种子发芽势随着ZnO NPs浓度升高而升高；而50～500 mg·L-1的试验组随着ZnO NPs浓度升高而降低(图4)。20～50 mg·L-1浓度范围的种子发芽势较高，其中50 mg·L-1ZnO NPs试验组的发芽势分别比无添加纳米氧化锌和20 mg·L-1Zn2+的对照组高34.5%和56.0%，同时也显著高于10 mg·L-1，500 mg·L-1和1 000 mg·L-1(P<0.05)。

注：*及不同字母表示处理间差异显著(P< 0.05)。下同。

Note: * and different letters mean significant differences between treatments at 0.05 level.The same is as below.

图3 不同浓度ZnO NPs处理下玉米种子发芽率
Fig.3 Maize seed germination rates with different concentrations of ZnO NPs

图4 不同浓度ZnO NPs处理下玉米种子发芽势
Fig.4 Maize seed germination energy with different concentrations of ZnO NPs

由图5，6可知，种子发芽指数和种子活力指数均随着纳米氧化锌浓度升高呈先升高后降低的趋势。20～100 mg·L-1ZnO NPs处理的种子有较高的种子发芽指数，其中，50 mg·L-1和ZnO NPs的试验组的种子发芽指数最高，除20 mg·L-1和100 mg·L-1ZnO NPs处理外，发芽指数均显著高于其他处理(P<0.05)。50 mg·L-1和100 mg·L-1ZnO NPs处理的种子活力指数均显著高于其它处理，且50 mg·L-1ZnO NPs的试验组种子活力指数比无添加纳米氧化锌和20 mg·L-1Zn2+的对照组分别显著高80.5%和107%(P<0.05)。而高浓度(1 000 mg·L-1)ZnO NPs处理显著抑制了种子活力指数。

2.3 不同浓度ZnO NPs对玉米种子萌发后胚根、胚芽生长状况的影响

不同浓度ZnO NPs处理对玉米种子萌发7 d后的玉米根、芽伸长具有差异性(图7)。由表1可知，玉米的生物量也发生了变化，随着纳米氧化锌浓度的增加，根系鲜重显著增加，在100 mg·L-1ZnO NPs处理时达到最高，比无添加纳米氧化锌和20 mg·L-1Zn2+的对照组分别显著高41.7%和42.6%；此外，50 mg·L-1ZnO NPs处理下的根系鲜重比无添加纳米氧化锌和20 mg·L-1Zn2+的对照组分别显著高18.4%和19.1%(P<0.05)。浓度为1 000 mg·L-1ZnO NPs处理时的根系鲜重比无添加纳米氧化锌和20 mg·L-1Zn2+的对照组显著低34.4%和34.0%，其他处理的根系鲜重与对照差异均不显著。芽鲜重随纳米氧化锌浓度的变化与根系鲜重的变化趋势相似，不同的是芽鲜重在50 mg·L-1ZnO NPs处理时达到最高，比无添加纳米氧化锌和20·mg L-1Zn2+的对照组均显著高27.1%，而1 000 mg·L-1ZnO NPs处理则显著降低了芽鲜重(P<0.05)，其他试验组与对照组的差异均不显著。

表1 不同浓度ZnO NPs对玉米种子胚根及胚芽生长状况的影响Table 1 Maize radicle and plumule growth with different concentrations of ZnO NPs

注：同列不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)(数据为平均数±标准差)。**表示在0.01水平上差异极显著(P<0.01)。

Note: Different letters in the same column mean significant differences between treatments at 0.05 level (Data are average value ± standard deviation).** means significant differences between treatments at 0.01 level.

与对照及20 mg·L-1Zn2+处理相比，低浓度(50 mg·L-1和100 mg·L-1)ZnO NPs处理显著增加了玉米胚根长，而1 000 mg·L-1ZnO NPs显著抑制了玉米胚根的伸长(P<0.05)。整体上，玉米胚根的长度随纳米氧化锌浓度的升高先增加后降低，这表明适宜浓度范围内纳米氧化锌的处理有助于玉米胚根伸长。

低浓度(10 mg·L-1、20 mg·L-1、50 mg·L-1和100 mg·L-1)ZnO NPs处理促进了种子胚芽的生长，随着纳米氧化锌浓度的增加胚芽长度呈先增加后减少的趋势，高浓度(500 mg·L-1和1 000 mg·L-1)ZnO NPs抑制了种子胚芽的生长(表1)。当ZnO NPs浓度为50 mg·L-1时，胚芽长度达到最高，比无添加纳米氧化锌和20 mg·L-1Zn2+的对照组显著高16.4%和14.7%，同时也显著高于10 mg·L-1和200～1 000 mg·L-1的试验组(P<0.05)。

纳米氧化锌极显著影响玉米不定根数(P<0.01)，其随纳米氧化锌浓度的变化趋势与胚芽生长一致(表1)。在浓度50 mg·L-1下，不定根数最高，比20 mg·L-1Zn2+的对照组显著高21.6%，比1 000 mg·L-1的试验组显著高33.8%(P<0.05)。

2.4 不同浓度ZnO NPs对玉米幼苗根系糖代谢关键酶活性的影响

2.4.1 糖酵解途径关键酶活性的变化。从不同浓度纳米氧化锌对玉米种子萌发的影响不难得出，低浓度(20 mg·L-1、50 mg·L-1和100 mg·L-1)ZnO NPs促进了种子萌发和幼苗生长，因此我们对筛选出的浓度进行了碳代谢关键酶活性的分析。由图8可知，纳米氧化锌显著影响了糖酵解关键酶己糖激酶、醛缩酶和磷酸果糖激酶活性(P<0.05)。浓度为50 mg·L-1ZnO NPs处理下的己糖激酶活性比无添加纳米氧化锌和20 mg·L-1Zn2+的对照组分别显著高125%和86.0%(P<0.05)；而20 mg·L-1、100 mg·L-1的试验组与对照组差异不显著(图8A)。磷酸葡糖糖异构酶活性与己糖激酶活性变化趋势相同，但处理间差异未达到显著水平(图8B)。与己糖激酶和磷酸葡萄糖异构酶活性变化不同的是，100 mg·L-1ZnO NPs显著降低了醛缩酶活性(图8C)。磷酸果糖激酶活性随纳米氧化锌浓度升高先升高后降低，同对照相比100 mg·L-1的ZnO NPs显著降低了磷酸果糖激酶活性，而较低浓度(20 mg·L-1、50 mg·L-1)ZnO NPs处理的磷酸果糖激酶活性与对照组差异不显著(图8D)。综上可见，糖酵解途径的调控因纳米氧化锌浓度的不同而有所不同，且幼苗根系糖酵解途径不同酶的活性变化并不是完全一致。

2.4.2 脲苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的变化。脲苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性随纳米氧化锌浓度升高先增加后降低，浓度为50 mg·L-1ZnO NPs处理下的脲苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性比无添加纳米氧化锌的对照组显著高60.2%(P<0.05)，而20 mg·L-1、100 mg·L-1的试验组与对照组差异不显著(图9)。

3 讨论与结论

近年来，纳米技术的广泛应用为农业领域带来了机遇和挑战。纳米材料对植物的各种形态和生理过程具有影响，对植物生长发育有益也有害，这取决于纳米材料的应用方式、大小、浓度以及植物种类等[15]。本研究发现，50 mg·L-1ZnO NPs浸种是提高玉米种子发芽速度和增强种子活力的最佳浓度，这可能与纳米颗粒对种子的渗透有关[16]。由于纳米颗粒的小尺寸效应，所产生的磁场与种子的磁场形成了主动靶向性，提高了种子对水分的吸收能力，促进了种子萌发[17]。而浓度高于100 mg·L-1时，不利于种子萌发甚至对种子生长产生抑制作用。除了对种子萌发产生影响，萌发后胚根、胚芽的生长也对纳米氧化锌处理响应显著。50 mg·L-1和100 mg·L-1ZnO NPs浸种促进其根系及胚芽的生长和伸长，这有利于生物量的积累。已有研究证明，用浓度1 000 mg·L-1ZnO NPs喷洒花生叶片，可以促进其种子萌发，提高幼苗活力，增加株高和鲜重，并认为这可能是由于纳米氧化锌处理后，种子中锌的浓度更高所导致的；而锌在保护和维持细胞膜结构稳定性方面起着重要作用，且与蛋白质合成、膜功能、细胞伸长和对环境胁迫的耐受性密切相关[18]。浓度为0.1 mg·L-1ZnO NPs促进了花叶芦竹种子萌发和根茎生长[13]，这表明植物不同，处理方式不同，促进种子萌发的纳米氧化锌最适浓度也不同。

种子萌发过程中，种子内贮藏的蔗糖会进行分解代谢转化为果糖和葡糖糖，为种子萌发生长提供能量。糖酵解途径在高等植物中氧化蔗糖产生ATP、NADH和丙酮酸，需要己糖激酶、磷酸果糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶和醛缩酶等多种酶的催化作用。糖酵解代谢途径通过自身的正向调控和反馈抑制作用，维持糖酵解代谢处于最优条件，提高植物对环境的适应能力[19]。本研究证明，50 mg·L-1ZnO NPs处理显著提高了糖酵解活化需要的己糖激酶活性。己糖激酶除了催化己糖磷酸化，维持植物合成碳流和呼吸作用外，还可作为己糖感受器，参与植物的糖信号转导过程[20]。己糖激酶催化己糖为磷酸己糖是糖酵解途径的开端，较高的己糖激酶活性有助于己糖磷酸化和糖信号产生，为细胞呼吸和植物生长提供代谢物质和能量。Winder等[21]研究表明，己糖激酶在葡萄糖传感器中起核心作用，最终参与种子萌发及植物生长等过程。醛缩酶在糖酵解过程中催化3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮的醇醛缩合，可逆的生成果糖-1，6-二磷酸，也是光合器官中碳固定途径的关键酶，参与淀粉合成途径[22]。种子萌发过程中，种子中贮藏的淀粉被分解利用，产生的中间产物和能量用于萌发生长。而糖质新生需要消耗较多的能量，这不利于种子萌发阶段的能量代谢平衡，所以较低的醛缩酶活性会抑制糖质新生，利于种子萌发[23]。本研究发现，50 mg·L-1，100 mg·L-1ZnO NPs处理抑制了醛缩酶活性，这可能与较高的Zn2+含量有关。高品等[24]研究结果也表明，8 mmol·L-1Zn2+抑制了醛缩酶活性。磷酸果糖激酶是糖酵解途径的一个关键节点，它的存在会伴随着大量能量的消耗，而他的缺失又会致使还原力失衡，影响下游代谢途径[25]。本研究发现，20 mg·L-1和50 mg·L-1ZnO NPs处理下磷酸果糖激酶活性与无添加纳米氧化锌的对照组差异不显著，这表明适宜浓度的纳米氧化锌使磷酸果糖激酶活性处于能量与还原力平衡的状态。脲苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化脲苷二磷酸葡萄糖(UDPG)与焦磷酸(PPi)生成1-磷酸葡萄糖(G-1-P)的可逆反应，还参与细胞壁的生物合成[13,26]；在发育的种子等组织内，脲苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶可以使尿苷二磷酸葡萄糖脱离蔗糖合成酶，使平衡像蔗糖降解的方向进行[27]。本研究表明，50 mg·L-1ZnO NPs处理下脲苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性显著高于无添加纳米氧化锌的对照组，这有利于细胞壁组分的前体物质纤维素及胼胝质等的合成。已有研究表明，植物生长、繁殖与UGP基因的表达密切相关[28]。

综上，50 mg·L-1纳米氧化锌浸种促进了糖酵解代谢和细胞壁的生物合成过程，有利于促进种子萌发，提高幼苗活力。但是，高等植物的糖代谢过程是多条途径综合、动态调控的，适宜浓度的纳米氧化锌对种子萌发的促进作用机制还有待进一步研究。目前，关于纳米氧化锌在田间条件下对作物影响的研究还不多，如何正确利用纳米氧化锌指导农业生产仍需继续探讨。