用LC-MS 法测定人血浆中顺式阿曲库铵的浓度

辛 博，万丽丽，王 婧，刘金变，霍 炎，郭 澄 （上海交通大学附属第六人民医院：.药剂科, .麻醉科，上海 200233）

顺式阿曲库铵（cisatracurium, CA）是一种新型中时效非去极化肌松药，其结构式如图1，因其代谢方式（Hofmann elimination，霍夫曼降解）独特，同时释放较低水平的组胺，在临床麻醉过程中被广泛应用。因与其他非去极化肌松药一样，存在术后肌松残留作用[1]，且已成为麻醉后呼吸系统不良事件的主要原因。因此，为保证患者围术期安全，对顺式阿曲库铵进行血药浓度监测十分必要。

CA 的稳定性主要受温度和pH 影响，温度和pH 升高可加快其消除，因此离体后的生物样本稳定性是血药浓度监测方法建立的一个难点。国内外文献报道测定人血浆中CA 浓度的方法主要为高效液相色谱荧光检测法（HPLC-FD）及高效液相色谱串联质谱法（LC-MS）[2-6]，但样本前处理方法较为复杂。本研究在既往文献报道的基础上，建立了一种更加简便、准确、快速、稳定的LC-MS 方法，适用于人血浆中CA 的血药浓度测定。

1 仪器与试药

图 1 顺式阿曲库铵的结构式

高效液相色谱仪（Agilent 6410，美国Agilent 公司）；Triple Quad 三重四极杆质谱仪，配电喷雾（ESI）离子源（美国Agilent 公司）；纯水机（Millipore）；分析天平（BP211D，德国Sartorius 公司）。对照品顺式阿曲库铵（cisatracurium，CA，批号：C496700，纯 度 90%，Toronto Reasearch Chemicals Inc 公司）；对照品盐酸普罗帕酮（propafenone hydrochloride，PPF，批 号：101190-201101，纯度99.9%，中国药品食品检定研究院）；乙腈、甲酸均为质谱纯（美国TEDIA 公司）；水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 分析条件

2.1.1 色谱条件

Agilent SB-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm, 3 μm），柱温35 ℃；流动相A 为0.1%甲酸水溶液，B 为0.1%甲酸乙腈溶液。线性梯度洗脱：0 ～1 min,20% B；1～3 min，50% B；3 ～5 min，20% B; 5 ～10 min，20% B。流速0.3 ml/min；进样量2 μl。

2.1.2 质谱条件

采用正离子工作模式；离子源为ESI 源；多反应监测（multiple reaction monitoring, MRM）。毛细管电压4 000 V；干燥器温度350 ℃；干燥气流速12 L/min；雾化器压力35 psi。MRM 监测离子对，离子驻留时间、碰撞诱导解离电压及碰撞能量等参数见表1。典型质谱图见图2。

表 1 质谱条件

图 2 HPLC-MS 色谱图

2.2 对照品及内标溶液配制

CA 标准储备液：精密称取CA 10 mg 置10 ml容量瓶，加入2%甲酸甲醇溶液至刻度，溶解混匀，配制成相当于CA 质量浓度为1 mg/ml 的储备液，于冰箱（4 ℃）备用。

CA 标准工作液：精密吸取CA 储备液适量，用50%甲醇水溶液配制成系列浓度的工作溶液，其中，CA 质量浓度分别为5 000、2 500、1 000、500、250、100、20 ng/ml。

PPF 标准储备液：精密称取PPF 0.4 mg 置2 ml容量瓶，加甲醇至刻度，溶解混匀，配制成相当于PPF质量浓度为0.2 mg/ml 的储备液，于冰箱（4 ℃）备用。

PPF 标准工作液：精密吸取PPF 储备液适量，配制成200 ng/ml 的含内标乙腈溶液。

2.3 血浆样品处理

精密吸取血浆30 μl，加入2%甲酸水溶液30 μl，振摇10 s，再加50 μl 含内标乙腈溶液后旋涡振荡10 s，12 000 r/ min 离心10 min，转移上清液置进样瓶，进样。

2.4 标准曲线及最低定量限

取空白人血浆，精密加入不同浓度的对照品溶液，配制成CA 浓度为500、250、100、50、25、10、2 ng/ml 的血浆标准品。以浓度为X 轴，样品峰与内标峰的比值为Y 轴，进行线性回归，经“1/X”权重得回归方程分别为：Y = 7.43×10-3+ 1.99 × 10-2X(r = 0.996 5)。结果表明，CA 在2～500 ng/ml 内，线性关系良好。本方法CA 的定量下限为2 ng/ml。

2.5 系统精密度与准确度（回收率）

配制CA 浓度分别为8、80、400 ng/ml 的血浆样品，日内误差以3 个浓度各5 个样品的测定结果表示；日间误差以3 个浓度样品分别3 个批次结果表示。人空白血浆分别加入不同浓度CA 工作溶液，按照“2.3”项下方法提取后，相同色谱条件进行浓度测定。同时测定用流动相稀释为相应浓度的无基质溶液的峰面积，以计算绝对回收率。结果如表2 所示。

表 2 CA 人血浆样品的系统精密度与准确度（回收率）

2.6 稳定性试验

空白血浆分别配制成8、80、400 ng/ml 的样品，每批次各3 个，分别考察其①室温下放置4 h；②处理后室温放置24 h；③-80 ℃放置14 d 的稳定性。结果如表3 所示。

2.7 基质效应

取6 个不同来源的人空白血浆30 μl，除不加内标外，其余按“2.3”项下操作，取上清液，分别制备成CA 浓度为31.25 和1 000 ng/ml；PPF 浓度为200 ng/ml 的溶液，进样测定，记录峰面积。另用流动相将CA 稀释成31.25 和1 000 ng/ml；PPF 浓度为200 ng/ml 浓度的溶液，进样测定，记录峰面积。

表 3 CA 人血浆样品不同条件下的稳定性

基质效应=（空白基质中添加工作溶液峰面积/重组溶液中添加工作溶液峰面积）×100%

CA 的基质效应为52%（RSD 2.09%～15.33%）。PPF 的基质效应为96.71%（RSD4.6%）。

2.8 方法在治疗药物监测中的应用

采用肌松仪监测患者注射苯磺顺式阿曲库铵后神经肌肉阻滞程度。给予4 个成串刺激（train of four stimulation，TOF），给药后，T4 最先发生衰减，T1 最后衰减。当T1 消失即仪器显示为0 时，肌肉阻滞程度最大，随后逐渐恢复。分别在T0（T1 消失至0）、TOFr 50（恢复至50%）、TOFr 90（恢复至90%）时采集输液对侧动脉血3 ml，并及时保存于4 ℃冰箱中。采用建立的方法测定样本血药浓度，结果见表4。同时记录T0（给药结束到T1 消失至0）、TOFr50（给药结束到恢复至50%）、TOFr90（给药结束到恢复至90%）发生所需时间，结果见表5、表6。

表 4 6 例受试者血浆中CA 血药浓度测定结果

表 5 6 例受试者临床资料

表 6 6 例受试者达到各TOF 值的时间

3 讨论

CA 的代谢途径主要为Hoffman 消除[7]，Hoffman消除受温度和pH 值的影响。有研究显示[8]，将苯磺顺阿曲库铵注射液稀释于20%的甲醇中，室温下，10～15 min 即可检测到大量降解产物N-甲基四氢罂粟碱和单季丙烯酸酯。血浆的pH 值在7.4 左右。我们发现，在CA 血浆样本前处理过程中，如果不加入酸调节pH 值，即使在-80 ℃的储存条件下，CA 仍然会很快降解（结果未在文中体现）。为此，我们考察了不同比例的甲酸，最终确定了在样本前处理过程中加入2%的甲酸能够保证血浆中CA 的稳定性。在既往报道中，多是加入一定浓度的硫酸来调控pH 值[2-6]。硫酸为有机酸，对测定仪器尤其是质谱仪的离子源损害很大。同时，加入硫酸并不能保证室温条件下样本的长时间稳定（＜4 h）[9]。本研究结果显示，加入2%的甲酸，室温下样本稳定性可保持在24 h 以上。此外，我们的样本前处理过程并不需要经过离心-上清液真空浓缩或氮吹浓缩-复溶-离心取上清液等[2-6,9]复杂过程，更为省时、省力。经验证，本研究建立的方法测定CA 血浆样本的精密度、准确度和稳定性均符合方法学要求。该方法更加简便、准确、快速、稳定，可应用于临床CA 治疗药物浓度的监测。