疏肝健脾法对2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的影响＊

贾晓蕾，王 磊，秦灵灵，吕翠岩，张程斐，刘铜华＊＊

（1. 北京中医药大学第三附属医院 北京 100029；2. 北京中医药大学 北京 100029；3. 首都医科大学附属北京中医医院 北京 100069）

近些年，我国糖尿病发病率大为增加，而今已经成为全球当之无愧的糖尿病高发病率国家[1]。2 型糖尿病是糖尿病发病患者中占绝大多数的类型。2 型糖尿病病人中有近四分之一的人存在胰岛素抵抗，胰岛素抵抗成为2型糖尿病患病的主要发生进展的因素之一。多种糖尿病代谢并发症的发展也在在胰岛素抵抗的基础上开始的[2]。现代医学治疗胰岛素抵抗主要是使用有一定副作用的二甲双胍、噻唑烷二酮类等。祖国传统医学在胰岛素抵抗相关方面治疗进行了大量的研究，应用中医药干预胰岛素抵抗，恰能填补当前西药治疗之空白。精神状态出现异常能够增加胰岛素抵抗和糖尿病发病风险[3]。中医疏肝健脾法能够改善糖尿病相关症状并具有一定的降糖作用，并已有一定的临床文献基础。中医《伤寒论》经典方剂四逆散及《丹溪心法》中的痛泻要方是其中的代表。但其作用能否改善胰岛素抵抗、防止或延缓糖尿病的发生、发展，尚缺乏相关临床和实验研究。由此，不妨做出假设：从“治未病”角度来讲，中医疏肝健脾法可能能够防止或延缓糖尿病的发病和进展[4]。中医疏肝健脾法能够改善糖尿病相关症状并具有一定的降糖作用，我们需要从“治未病”角度进一步探索疏肝健脾法预防和治疗2 型糖尿病的作用机制，选方四逆散及痛泻要方合剂，通过对患者胰岛素相关指标等水平的测定，探索疏肝健脾法对2 型糖尿病及胰岛素抵抗的调控作用。

表1 第4周末KK-Ay小鼠28天空腹血糖变化（n = 6）

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验选用无特定病原体级实验动物（SPF级）雄性KK-Ay 小鼠24 只（6-7 周龄），对照组选用SPF 级雄性C57BL/6J 小鼠6 只（6-7 周龄），实验动物采用单笼喂养。

动物来源北京华阜康生物科技股份有限公司；实验动物许可证号：SYXK（京）2019-0022。

1.2 药物与试剂

四逆散及痛泻要方合剂（由柴胡6 g、枳实6 g、芍药6 g、甘草6 g、陈皮6 g、防风3 g、白术6 g组成），北京康仁堂有限公司生产配方颗粒；盐酸二甲双胍片（批号：ABF2569 规格0.5 g/片）,中美上海施贵宝制药有限公司；高脂饲料，北京华阜康生物科技股份有限公司；胰岛素ELISA 试剂盒，公司：abcam，批号：GR313414-1。美国强生全血糖仪及配套试纸。

1.3 仪器

酶标仪（Multiskan MK3 型，Thermo 制造）；低温高速离心机（3κ30，美国Sigma 公司制造）；水浴锅（荣华仪器厂）；高效液相色谱仪（上海精科/仪电上分LC-210型）。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及饲养方法

选取两次血糖值≥13.9 mmol·L-1（非同日随机血糖）的6-7周龄KK-Ay小鼠24只，随机分成模型组、二甲双胍组、中药高剂量组、中药低剂量组。正常组选择6 只6-7 周龄C57BL/6J 小鼠作为正常组入组。C57BL/6J 小鼠给与普通饲料喂养，KK-Ay 小鼠给与KK 高脂鼠料(鼠料含有58%脂肪，25.6%碳水化合物，16.4%蛋白质)。各组小鼠皆适应性喂养1周。

1.4.2 给药

每天以灌胃方式给药。给药剂量：盐酸二甲双胍片 35 mg·kg-1·d-1（按成人剂量 2500 mg·70 kg-1·d-1换算）；中药高剂量组（5.52 g·kg-1·d-1），中药低剂量组（1.84 g·Kg-1·d-1）；中药剂量以生药计，均根据相关文献结合临床最大成人剂量得出。模型组和空白组予同剂量的生理盐水。各组均按0.1 ml·10 g-1·d-1给药（但不超过0.8 ml）。连续给药4周。

1.4.3 检测方法

（1）空腹血糖

剪尾取血，用血糖仪进行检测。

（2）口服葡萄糖耐量实验（OGTT）

给药第3 周，小鼠禁食不禁水12 h，50%葡萄糖2 g·kg-1灌胃，尾静脉取血，测定0,30,60,120 min 血糖，计算曲线下面积（AUC）=0.5*(Bg 0 min+Bg 30 min)/2+ 0.5*(Bg 30 min + Bg 60 min)/2 + 1*(Bg 60 min + Bg 120 min)/2。

（3）空腹血清胰岛素水平测定（Fins）及胰岛素敏感指数测定

空腹血清胰岛素水平测定采用放射免疫法测定。胰岛素敏感指数HOMA-IS = 1/HOMA-IR = 22.5（/空腹血糖水平（FPG，mmol·L-1）× 空腹胰岛素水平（FINS，mIU·L-1））

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 四逆散及痛泻要方合剂对KK-Ay 小鼠空腹血糖的影响

第4周末，与正常组比较，模型组空腹血糖呈逐渐升高趋势，存在明显的空腹血糖异常（P＜0.01）。二甲双胍组、中药低剂量组、中药高低量组皆对血糖有控制作用（P＜0.05）。二甲双胍组作用优于中药高剂量组（P＜0.01）。这说明四逆散及痛泻要方合剂可对KK-Ay 小鼠空腹血糖有降低作用，但是四逆散及痛泻要方合剂的作用并不优于二甲双胍（表1）。

表2 第3周末KK-Ay小鼠OGTT、AUC的变化

第4周末空腹血糖：正常组非正态分布，进行非参数检验。模型组与正常组相比较P＜0.01，组间有差异。与模型组比较，中药低剂量组P＜0.05，二甲双胍组、中药高剂量组与模型组比较P皆小于0.01;与二甲双胍组比较，二甲双胍组和高剂量组皆有显著性差异P＜ 0.01。

2.2 四逆散及痛泻要方合剂对KK-Ay 小鼠OGTT、AUC的影响

第3 周末模型组较正常组AUC 明显升高（P＜0.01），二甲双胍组、中药低、高剂量组较模型组都可明显降低AUC（P＜0.01）。这说明四逆散及痛泻要方合剂可调节KK-Ay小鼠葡萄糖耐量，降低胰岛素抵抗指数（表2）。

2.3 四逆散及痛泻要方合剂对KK-Ay 小鼠空腹血清胰岛素的影响

与正常组相比较，模型组空腹胰岛素水平明显升高（P＜ 0.01）；与模型组相比较，二甲双胍组P＜ 0.01，低剂量和高剂量组P＜0.05；与二甲双胍组比较，低剂量组P＜0.01,高剂量组P＜0.05。这说明四逆散及痛泻要方合剂可降低KK-Ay 小鼠胰岛素血清水平（表3）。

表3 第4周末KK-Ay小鼠空腹血清胰岛素水平

2.4 四逆散及痛泻要方合剂对KK-Ay 小鼠胰岛素敏感指数的影响

与正常组相比，模型组胰岛素敏感指数降低（P＜0.01）;与模型组比较，二甲双胍组胰岛素敏感指数降低P＜ 0.01，中药高剂量组P＜ 0.05，中药低剂量组P＞0.05。这说明四逆散及痛泻要方合剂可提高KK-Ay小鼠胰岛素敏感指数（表4）。

表4 第4周末KK-Ay小鼠胰岛素敏感指数

3 讨论

胰岛素抵抗（IR）是指一种病理状态，在该状态下，正常浓度的胰岛素产生的靶组织（例如肝脏，肌肉和脂肪组织）细胞的水平低于相应的生物学效应[5]。环境与遗传因素往往相互影响，最终可以导致胰岛素抵抗。在胰岛素抵抗的情况下，随着时间的流逝，胰岛β 细胞代偿性分泌增加会导致β 细胞衰竭，导致血糖控制不佳，从而导致2 型糖尿病[6]。因此，胰岛素抵抗是导致2型糖尿病发生和发展以及各种代谢关联疾病（如糖耐量降低，高血压，中枢性肥胖，血脂异常和动脉粥样硬化）发生的主要因素之一[7]。由胰岛素抵抗和相关代谢紊乱引起的一系列疾病统称为胰岛素抵抗综合征（IRS）或代谢综合征（MS）。IDF 将胰岛素抵抗和胰岛素抵抗综合症（代谢综合症）视为21 世纪世界面临的主要健康问题之一[8]。因此，对胰岛素抵抗的全面，详细的研究对于2 型糖尿病及其相关并发症的预防和治疗具有重要的理论和实践意义。

在现代社会中，人们的社交节奏不断加快，生活，工作和研究压力很大，甚至长期持续出现紧张，焦虑等情绪。精神因素在糖尿病及其并发症中的重要作用最近几年得到医学界的认可[9]。西医干预胰岛素抵抗以二甲双胍、噻唑烷二酮类为主，但是作为胰岛素增敏剂的罗格列酮因为升高心血管事件风险已经禁用，吡格列酮亦被发现可能增加罹患膀胱癌风险而面临下架危险[10]。因此，那么，可以使用那些西药来改善胰岛素抵抗以及葡萄糖和脂类代谢？情况不容乐观。二甲双胍目前在糖尿病预防指南中被用作一线药物，并在临床实践中被广泛使用。但其胃肠道不良反应令不少患者难以耐受，最终停药。这极大限制了临床上针对胰岛素抵抗的治疗。

在药理研究中发现，降糖机理通过单味中药及其复方都可体现，归纳起来可以通过以下多种途径：①减少胰岛素拮抗物。如降低胰高血糖素等；②动态调整糖原合成及分解；③增加糖酵解，提高外周细胞组织对血清葡萄糖的利用率；④增加胰岛素受体数量和亲和力，减轻受体缺乏症；⑤目标组织细胞对胰岛素敏感并有反应，从而降低受体后抵抗力。以上充分显示了中药干预胰岛素抵抗多位点、多层次、多途径及多效应的优势[11]。

胰岛素抵抗是现代医学发展的新词汇，其当属中医学“消渴”“消瘅”等范畴[12]。中医认为脏腑功能虚弱是其发生的内在因素，以肝脾肾最为重要；而饮食、情志、运动、房劳等是为外在因素。而情志因素在当今时代表现的愈发明显。来自于生活工作学习等方面巨大的压力，造成人们紧张焦虑、压抑、甚至愤懑，通常头痛、失眠、便秘、月经不调等症状伴随出现。长期的慢性刺激或压力事件会导致患者焦虑或压力大，并且无法缓解容易导致肝郁的症状[13]。“心境愁郁，内火自燃，乃消症大病”，这句话的意思是精神或情志是为肝所主的，从肝治疗糖尿病是有相关理论依据的。有研究表明，焦虑症状在糖尿病患者中很常见，由肝功能疏泄失常引起消渴，再由消渴反过来影响肝功能，这两者往往互为因果[14]。糖尿病患者从西医上来说往往是出现胰岛素绝对或相对不足，引起出现胰岛素抵抗现象，从中医来看是脾主运化，转运五谷后天之气能力较前降低，气血津液停滞、郁、瘀、痰、湿等互结，发为消渴[15]。

本研究中选用中医《伤寒论》经典方剂四逆散及《丹溪心法》中的痛泻要方合方，柴胡、枳实、芍药、甘草、陈皮、防风、白术组成。四逆散具有具有调和肝脾，透邪解郁，疏肝理脾之功效，痛泻要方具有调和肝脾，补脾柔肝之功效。二方合用，共奏调和肝脾，柔肝理脾之效。方中柴胡为君，以奏疏肝解郁，升清阳之效，从而得使郁热得解外透；白芍为臣，功效为养血敛阴，郁热解而阴不伤与柴胡一升一敛相配；佐以枳实以为行气，可以使气机舒畅；炙甘草为使，甘温缓急，调和诸药。白术燥湿健脾，陈皮理气醒脾。是为疏肝健脾法的常用处方。

本实验采用自发性糖尿病KK-Ay 小鼠研究疏肝健脾法对糖尿病抵抗的影响，实验期间自发性糖尿病KK-Ay 小鼠空腹血糖显著升高，OGTT 出现异常，血清胰岛素分泌水平增加，胰岛素敏感指数降低。西药对照采用了二甲双胍，二甲双胍可明显降低自发性糖尿病KK-Ay 小鼠空腹血糖、调节KK-Ay 小鼠OGTT 中血糖水平，降低空腹血清胰岛素水平及提高胰岛素敏感指数。中药采用了疏肝健脾法中的代表方四逆散及痛泻要方合剂，实验结果证明中药高剂量组能够降低自发性糖尿病KK-Ay 小鼠空腹血糖，调节KK-Ay 小鼠OGTT 中血糖水平，降低空腹血清胰岛素水平及提高胰岛素敏感指数，但效果并不优于西药对照二甲双胍，但是仍然可以说明中药也有确切的疗效，可以达到降低自发性糖尿病KK-Ay小鼠血糖水平，改善糖耐量异常，提高胰岛素敏感性，从而能够进一步减轻减缓胰岛素抵抗的作用。