基于网络药理学与化学成分研究的连花清瘟胶囊治疗新型冠状病毒肺炎作用机制探讨＊

王旭杰 ，张菀桐 ，王妙然 ，周忠阳 ，4，朱宝琛 ，李嘉茜 ，张 蕊 ，3，张雪雪 ，李秋艳 ＊＊，翁维良

（1. 中国中医科学院西苑医院，北京 100091；2. 中国中医科学院研究生院，北京 100700；3. 北京中医药大学，北京 100029；4. 密云区北庄镇社区卫生服务中心，北京 101503；5. 北京中医药大学东直门医院，北京 100070）

自2019 年12 月至今，由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染人体后所致的新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）的感染人数与死亡人数均在全世界范围内飞速激增，对人类社会造成巨大的冲击，导致的损失不可估量。世界卫生组织（world health organization，WHO）已将本病定义为全球大流行病，COVID-19 也是人类历史上首次面对的由冠状病毒引发的大流行病[1]。

面对疫情来袭，中国积极主动地履行着国际责任，与国际社会共同携手为抗击新冠肺炎疫情付出了诸多坚实行动[2]。随着对COVID-19 治疗经验的积累以及对疾病临床表现与病理情况认识的逐步深入，中国在不断探索着治疗新冠肺炎的有效诊疗方案[3]。在中医治疗方面，连花清瘟胶囊可用于治疗轻型与普通型肺炎引起的咳嗽发热、乏力症状。连花清瘟胶囊（Lianhua Qingwen Capsule，LQC）是以中医学理论为指导，由治疗外感病证的中医名方融合化裁而成，方中内含炙麻黄、炒苦杏仁、石膏、连翘、金银花、板蓝根、鱼腥草、绵马贯众、广藿香、红景天、大黄、薄荷脑与甘草共13味中药，具有清瘟解毒，宣肺泄热的功效[4]。多项临床研究表明[5-8]，参照《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》给予轻型、普通型新冠肺炎患者西医抗病毒、对症治疗、抗生素药物与营养支持等常规治疗的基础上，联合使用连花清瘟能够提高治疗效果，可明显改善发热、咳嗽、胸闷、乏力等临床症状，同时还能调节外周血中炎症因子的表达，降低转重症率，对于治疗新型冠状病毒肺炎具有十分积极的意义。由于目前连花清瘟胶囊治疗COVID-19 与防治SARSCoV-2 的潜在机制尚不明确，故本研究以连花清瘟胶囊所含化学成分与入血成分研究为基础，借助网络药理学与分子对接等方法对其治疗新冠肺炎的潜在活性成分与作用靶点进行相关验证分析并预测可能的作用机制，为深入探索LQC 治疗COVID-19 提供具有研究价值的参考依据。

1 材料与方法

1.1 连花清瘟胶囊中活性化合物的收集与筛选

本研究的纳入文献采用凝胶、硅胶柱色谱，中低压色谱和高压制备液相色谱等多种色谱方法对连花清瘟胶囊进行分离与纯化，分别从连花清瘟胶囊孔树脂70%、50%与30%乙醇洗脱部分分离化合物，并依据波谱数据和理化性质进行结构鉴定[9-11]。入血成分研究则采用UPLC-Q-TOF-MS 技术，根据质谱裂解规律、色谱波峰的保留时间、对照品信息并结合文献对连花清瘟胶囊灌胃给药后的大鼠血浆内所含入血成分进行分析[12]。

1.2 潜在靶点的预测

借助中药系统药理学分析平台TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）与STITCH（https:////stitch.embl.de/）数据库检索化合物成分中靶点蛋白信息，使用UniProt（https://www.uniprot.org/）数据库进行相关转化，找出连花清瘟胶囊中各组分的基因靶点。本研究所选择的数据库虽有药物和药理学数据不够齐全等局限性，但整体具备较高的准确性与查全性，TCMSP数据库与STITCH 数据库中的靶点信息均来源自已验证的药物成分-靶点信息，而对于没有实验数据支持的信息，TCMSP 采用当前全球最大规模的加权系综相似度（weighted ensemble similarity，WES）模型进行高精度预测，STITCH 则通过对包括MEDLINE、PubMed Central 资源在内的文本信息挖掘与基于结构的预测方法进行补充，最终选取亲和力最高的组合，作为全球蛋白质知识中心的UniProt 数据库的信息结合了已审核的UniProtKB/Swiss-Prot 条目和未审核的UniProtKB/trembl条目，前者已由生物信息专家采集团队添加数据，后者由自动化系统注释[13-16]。以UniProt数据库操作为例：采用UniProt 数据库中UniProtKB 搜索功能，输入蛋白名称（protein name）并限定物种为人（Homo sapiens），筛选已检阅文件（Reviewed），将检索蛋白校正为其官方名称（Official Symbol），摘录标准基因名，获取准确的靶点信息。

1.3 COVID-19相关靶点的收集

在 GeneCards（https://www.genecards.org/）、DisGe NET（http://www.disgene-t.org/）、以及UniProt 数据库中输入 COVID-19、SARS-CoV-2、2019-nCoV 等关键词收集新冠肺炎相关靶点，同时在PubMed（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索SARS-CoV-2 病毒全基因组信息。汇总各数据库靶点信息为excel 表格，待后续分析。

1.4 核心靶点网络构建及靶点PPI网络分析

将连花清瘟胶囊的有效成分、作用靶点信息与COVID-19 的靶点信息导入Cytoscape 3.7.2，使用Merge 功能筛选出LQC 中药物成分对新冠肺炎的作用靶点，绘制有效成分-核心靶点网络图（Components-Targets Network）分析LQC 治疗新冠肺炎的作用靶点。将最终筛选出的核心作用靶点信息导入STRING（https://string-db.org/）数据库进行PPI 网络构建与数据分析。

1.5 KEGG通路与GO功能富集分析

Cytoscape 软件的插件ClueGo[17]整合了京都基因和基因组百科全书（KEGG）相关数据。本研究采用ClueGO 对获得的核心靶点进行KEGG 信号通路以及GO富集分析，探索LQC治疗COVID-19的关键信号通路与生物学过程。

1.6 核心成分分子对接

登陆 RSCB PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）下载人类血管紧张素转化酶II（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）与 SARS-CoV-2 S 蛋白受体结合域3D 结构PDB 文件（PDB:6M0J）。使用PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载核心药物成分3D 结构 mol2 格式文件。运用 AutoDockTools 1.5.6 软件对蛋白质进行加氢、去水等操作，并将化合物与靶蛋白文件格式转换为pdbqt 格式。使用Autodock Vina软件将受体与配体进行半柔性对接，如果结合能小于0 kj·mol-1则表明可自发结合，本研究选取结合能≤-5.0 kj·mol-1作为筛选依据[18]。

2 结果

2.1 连花清瘟胶囊有效化合物情况

由于许多传统中药制剂存在活性成分生物利用度低、口服吸收差的特点，同时中药复方制剂与中药单体内所含有效成分亦有区别，基于科研数据平台，以口服生物利用度≥30%来筛选中药单体活性成分，会导致遗漏很多活性分子，故本研究选择根据对连花清瘟胶囊的化学成分研究及血清药物化学研究选取相关化合物[19,20]。最终明确连花清瘟胶囊内共计64 个目前已知的化学成分与入血成分，其中化学成分研究结果包括46 个有效成分，入血成分研究结果包括22个有效成分，二者共有4 个相同成分。使用CytoScape软件绘制连花清瘟胶囊有效成分网络图（图1）。

2.2 有效化合物相关靶点信息

使用TCMSP 以及STITCH 数据库收集上述64 个化学成分信息后使用UniProt 将相关靶点蛋白信息转化为基因靶点信息，进行数据汇总分析后，最终得到25 个有效成分（包括连翘脂素、异甘草素、大黄素、大黄酸、山奈酚、槲皮素等成分）的共计146 个潜在靶点信息，使用CytoScape 软件绘制化合物-靶点信息网络图，详见图2。（注：蓝色为有效成分信息，红色为作用靶点信息。）

2.3 COVID-19的相关靶点信息

新冠肺炎为当前的研究热点，各数据库均有相关信息发布，如UniProt 数据库官网目前设有SARSCoV-2 信息专栏（COVID-19 UniProtKB）。本研究分别从GeneCards、UniProt、DisGeNET、PubMed 数据库搜索汇总COVID-19相关靶点信息，经过汇总计算后，共得到相关靶点122 个，其中包括了SARS-CoV-2 的S、N、M蛋白等与ACE2、IL6、IL10、TNF、CCL2、TMPRSS2、ADAM17等靶点（图3）。

2.4 连花清瘟胶囊治疗COVID-19 的核心成分-靶点网络及靶点PPI分析

运用Cytoscape 软件将所获活性成分及相关靶点信息与COVID-19 潜在作用靶点进行汇总分析，同时根据相关成分抗冠状病毒感染的研究作为补充，构建核心药物成分-靶点信息网络模型（图4）。（注：橙色为有效成分信息，绿色为作用靶点信息。）构建网络模型中包含26个节点（node）和26条边（edge），每条边表示活性成分与作用靶点之间的关系，其中包括12个有效成分信息与14个作用靶点信息，核心作用靶点分别为IL6、IL10、TNF、CCL2、ACE2、DPP4 等。将核心靶点信息导入STRING平台进行PPI网络分析后，将所得结果导入CytoScape 绘制PPI 网络图，其中节点的大小表示重要程度，线条的粗细代表了作用力强弱，结果见图5。

图1 连花清瘟胶囊有效成分网络图

图2 连花清瘟胶囊有效成分-靶点网络图

图3 COVID-19靶点网络图

2.5 核心靶点KEGG 通路分析

KEGG 通路分析结果显示（图 6），IL-17 信号通路、RIG-I 样受体信号通路、TNF 信号通路、AGERAGE 信号通路、疟疾等感染性疾病信号通路以及类风湿关节炎等炎症性疾病在连花清瘟胶囊治疗COVID-19的过程中发挥了重要的作用。

2.6 核心靶点GO功能富集分析

将核心靶点信息导入ClueGo 进行GO 富集分析，结果发现：连花清瘟胶囊治疗COVID-19 的核心靶点主要与IL-6 产生的负调控、B 细胞介导的免疫调节、调节免疫应答中涉及的细胞因子分泌以及受体生物合成过程等生物学过程有关，详见图7。

图4 连花清瘟胶囊治疗COVID-19核心成分-靶点网络图

图5 连花清瘟胶囊治疗COVID-19 PPI网络图

2.7 核心成分分子对接

目前，已有研究证明，连花清瘟胶囊在显著抑制SARS-CoV-2在细胞中复制的同时，可显著减少IL-6、CCL2、TNF-α 等促炎细胞因子的产生[21]。故本研究通过核心靶点信息情况筛选出大黄素、山奈酚、芦荟大黄素与芦丁作为四个核心药物成分与相关受体进行分子对接研究。

Autodock Vina 对配体与受体进行半柔性对接后，结果显示本研究选取的四个核心成分同与ACE2 结合的SARS-CoV-2 刺突蛋白受体结合域（spike receptor binding domain，RBD)的结合能分别为：大黄素（结合能-6.6 kj·mol-1）、山奈酚（结合能-6.8 kj·mol-1）、芦荟大黄素（结合能-7.5 kj·mol-1）、芦丁（结合能-5.5 kj·mol-1）,分子对接情况见图 8。

3 讨论

连花清瘟胶囊中所含的多种药物或有效成分在以往的研究中已被证明具有一定的抗冠状病毒潜力与效果，同时临床实践证明，连花清瘟胶囊在治疗轻型与普通型新冠肺炎患者方面的疗效良好[8,22]。2020年4 月14 日，国务院联防联控机制新闻发布会公布，连花清瘟胶囊可明显缓解COVID-19 患者的咳嗽、发热与乏力等症状，同时能有效减轻症状轻转重率，可用于新型冠状病毒性肺炎的常规治疗，国家药监局已批准将治疗COVID-19纳入到连花清瘟胶囊的药品适应症中[23]。

新冠肺炎属中医学“瘟疫”的范畴，人体外感疫毒之邪为主要病因，邪气入里化热则是重要的病机转归，与COVID-19 患者临床以发热为主要症状的表现相一致[8]。连花清瘟组方深刻体现出了中医药防治此类疫病丰富的治疗经验，以古代名医张仲景与吴鞠通在《伤寒论》和《温病条辨》中所记载的麻杏石甘汤、银翘散为基础方，同时借鉴明代吴又可《瘟疫论》中“治疫易早下”的经验，故而展现出“清瘟解毒，宣肺泄热”的功效。有研究发现[24]，多种传染性疾病与中医“热证”有着密切联系，热证多与免疫因素相关，从新冠肺炎的发病特点与临床表现可以判断出本病基本属于“热证”，而连花清瘟对促炎细胞因子的调节，以及本研究发现的LQC 治疗COVID-19 的核心作用靶点IL-6、IL-10、TNF 又属于热证网络中的重要基因靶点，因此连花清瘟胶囊治疗新冠肺炎不仅符合中医学辨证论治的功效特点，还与现代医学的疾病发生机制相契合。

图8 核心成分与SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域分子对接模式

本文通过网络药理学技术，对连花清瘟胶囊内所含各药物成分及入血成分所对应靶点等相关信息进行计算和预测，并通过数据库与文献查阅分析对比所得数据，经过核对校验后，笔者发现，连花清瘟胶囊中所含的大黄素、芦荟大黄素、山奈酚、芦丁等有效成分可能通过调节IL6、IL10、TNF、CCL2、MAPK14 等靶点起到调节免疫应答中涉及的细胞因子分泌、IL-6 产生的负调控以及B细胞介导的免疫调节等重要的生物调节进程，进而起到促进相关炎症因子的消除，改善新冠肺炎患者的相关免疫学指标的积极疗效。同时，作为核心作用靶点之一的DPP4 目前也被认为是预防并降低2型糖尿病患者感染新冠肺炎后出现急性呼吸道并发症风险的重要潜在靶点之一，因此连花清瘟胶囊的作用可能比目前已知的范围更为广泛[25]。

对于KEGG通路富集结果，本研究认为，除炎症因子相关信号通路外，RIG-I 样受体介导的信号转导通路（RIG-I-like receptor signaling pathway）亦需引起注意。该通路为人类体内重要的天然免疫抗病毒通路，在促炎因子与I型干扰素的产生及抗病毒感染的过程中至关重要,RIG-I 样受体在识别RNA 病毒并诱导一系列抗病毒因子产生的过程中减轻了病毒对人体的危害[26,27]。很多RNA 病毒则通过不同策略阻断RIG-I样受体信号通路[28]，而SARS-CoV-2 与该通路间的调控关系则尚不清楚。对于连花清瘟胶囊治疗COVID-19的作用机制，笔者认为LQC 除调控炎症因子相关信号通路外，可能也参与了对RIG-I 样受体信号通路的调控而激发出相应的抗病毒机制，借此发挥抑制SARS-CoV-2并减轻相关症状的作用。

有研究表明[29]，大黄素能通过阻断SARS-CoV S蛋白与ACE2 间的相互作用而起到抗病毒的功效。SARS-CoV-2 的 RBD 区 域 结 构 与 SARS-CoV RBD 十分相似，二者存在许多相同的残基，故本研究选取根据核心靶点信息情况筛选出的重要化合物成分，采取分子对接的方法对核心成分与该区域的关系进行探寻[30]。结果表明连花清瘟胶囊中所含有的大黄素、芦荟大黄素、山奈酚与芦丁可能通过与SARS-CoV-2 RBD 区域残基相结合，阻断病毒S 蛋白与ACE2 受体间的相互作用，从而达到抗病毒的功效。上述核心药物成分已被证实具有明显的抗炎作用，参与抑制促炎因子的转录，调控促炎酶的活性与相关炎症基因、信号通路的表达，同时还可减轻对相关组织的病理损伤，因此连花清瘟对COVID-19 的治疗作用很可能与之相关，而由于以上成分与SARS-CoV-2 刺突蛋白受体结合域结合能较强的发现，也为LQC 治疗COVID-19 的机制研究提供了新的探索方向[31-34]。此外，TMPRSS2、cathepsin B/L、ADAM17、STAT3 等分子也是治疗新冠肺炎的潜在靶点[35]。由于LQC组方对相关促炎细胞因子的调节作用以及有效成分山奈酚已被证实可通过调控Tyk-STAT 信号通路抑制STAT3 的激活以阻止炎症的发生发展，因此本研究认为连花清瘟胶囊很可能也参与了对STAT3 与ADAM17 的调控以抑制炎性细胞因子的激活，但具体的调控机制尚需研究证明。

综上所述，连花清瘟胶囊对新冠肺炎的治疗具有多成分、多靶点的特点，能通过调控不同的生物进程与相关信号通路达到对COVID-19 的干预作用，同时在中医学整体观念与辨证论治理论的指导下，法因证立，方随法出，药依方遣，实现了对“疫病”新冠肺炎的治疗效果[36]。连花清瘟胶囊能通过调节相关免疫因子及信号通路减轻COVID-19患者的炎症反应并缓解症状，同时所含有效成分可能参与对RIG-I 样受体信号通路的调节并与SARS-CoV-2 RBD 残基相结合起到抗病毒的功效。中药复方的成分众多且复杂，相关作用机制与相关药效团的研究始终是重点与难点，本研究尚有LQC 中所含的其余成分以及有待发掘的药效团未加入分析之内，因此，连花清瘟胶囊治疗COVID-19 的作用机制可能更加全面、复杂，对于何种成分以何种方式作用于靶点与参与通路调节的详细机制等具体细节应当继续加以深入研究[37]。在当前全球新冠肺炎疫情持续蔓延，SARS-CoV-2病毒发生突变、传染性增强的背景下，中医药需要做出更大的贡献，本研究运用网络药理学等方法从生物网络的角度较好地解释了LQC及COVID-19病证、方证间的关系，而基于网络药理学的作用机制研究也为连花清瘟胶囊治疗新型冠状病毒肺炎提供了重要的科学线索[38-40]。