基于ITS2序列的清风藤属药用植物分类鉴定研究＊

严福林，温 迪，任得强，王 波，徐文芬，孙庆文，魏升华

（贵州中医药大学药学院 贵阳 550025）

清风藤属Sabia隶属于清风藤科Sabiaceae，我国分布 16 种、5 亚种、2 变种，分为清风藤组Sect.Sabia与厚盘组Sect. Pachydiscus，主要集中分布于我国贵州、云南、广西等西南地区[1,2]。清风藤属植物大多入药使用，以小花清风藤药用最为广泛，具有清热利胆、祛风止痛等功效，常用于治疗肝炎、风湿痹痛、跌打损伤等疾病，亦为贵州苗族、布依族等少数民族常用药[3,4]。现代研究表明，清风藤属植物主要含有黄酮类、生物碱类及三萜类成分，具有显著的抗乙肝病毒、保肝护肝、降酶、抗炎等作用[5-12]。此外，清风藤属植物藤蔓特殊，适应性强，亦是良好的园艺造景植物。可见，该属植物具有较好的园艺价值和药物开发价值。

清风藤属植物花期较短，花瓣易脱落，果实较少，标本往往缺乏重要的鉴定器官，给该属植物的系统分类学研究和药材的真伪鉴别带来了挑战。王波、刘科成、温迪等[13-16]在显微镜下对清风藤属植物叶表皮细胞、淀粉、非腺毛、石细胞特征进行观察，该属植物的淀粉、非腺毛、叶表皮、石细胞形态、大小及纹孔等方面存在一定差异。郭文凯、孙庆文等[17]采用显微观察和数学统计学相结合的方法对凹萼清风藤、平伐清风藤、小花清风藤等9 种清风藤属种植物叶片表皮细胞显微表征进行了分析，发现毛被与细胞形态不同。以上研究取得了卓著的成效，为该属植物的分类及其药材鉴别提供了重要的参考。Sui 等[18]采用DNA 条形码技术，考察了trnH-psbA、rbcL-a、matK 3个候选系列在小花清风藤及其混伪品中的鉴定可行性，其中，3个候选系列均能将清风藤属植物与其他科属植物分开，matk + rbcL-a 可将小花清风藤与其他科（防己科、卫矛科、茜草科等）的7种植物区别开，为小花清风藤药材及其伪品的鉴定奠定了基础。但以上研究在取样上还有一定局限，研究种类较少，该属植物的分类与鉴定仍然依靠经验丰富的专家[19,20]。因此，探求一种准确简便又行之有效的鉴别方法来鉴别清风藤属植物的系统分类与鉴定仍然尤为重要。

内部转录间隔区2 序列（internal transcribed spacer 2，ITS2）是核基因上位于5.8S rRNA 基因区和大的亚单位编码区28S之间的一个片段，具有通用性好、变异性高、扩增和测序料率高等优点，是分析动植物系统进化、分类鉴定的较好基因片段。在淫羊藿属、人参属、兰属、等诸多药用生物的分类和鉴定中得到了广泛应用，是鉴定物种属及物种水平的研究热点[21-26]。本研究基于前期基础，对9种清风藤属药用植物38个产地样品进行ITS2序列分析，为清风藤属植物的分类鉴定与系统学提供参考，为该属植物的种质资源的保护与可持续开发利用奠定基础。

1 实验材料

本研究为清风藤科清风藤属植物的9 个物种，38份样品采自贵州、云南、重庆、台湾4 个地区。对应标本均由贵州中医药大学孙庆文教授鉴定，凭证标本存于贵州省生药重点实验室标本室。材料信息详见表1。

2 实验方法

2.1 样品DNA的提取与扩增

取硅胶干燥的叶片约20 mg，根据试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）操作提取样品总 DNA 样本。候选引物 ITS2，以 50 μL 体系：24 μL Tad PCR Matermix（2×，bluedye）、正反向引物各2 μL，总DNA 模板2 μL，ddH2O 20 μL 进行 PCR 扩增；扩增程序均为：94℃，5 min；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，45 s；40 cycles；72℃，10 min。引物序列为 ITS2（碱基序列（5'-3'））：2FATGCGATACTTGGTGTGAAT，3R-GACGCTTCTCCAGACTACAAT。经琼脂糖凝胶电泳中检测，条带单一且清晰的PCR产物送至上海生工纯化及测序。

表1 样品信息表

2.2 数据处理方法

测序后所得峰图应用Codon Code Aligner V 8.0.2（CodonCode Co.，USA）软件进行校对拼接，去除引物区和低质量序列。所得各序列经ClustalX V 2.0（Higgins D.G）进行多序列比对并查错；再应用The ITS2 Database在线工具（http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）进行注释剪切，去除序列两端5.8S 和28S 区；应用Geneious V 10.0.02 软件分析ITS2 序列的组成和结构特点；使用MEGA V 7.0软件计算（Kimura 2-parameter，K2P）距离值，比较ITS2序列的种间、种内变异，应用最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发育树。

3 结果与分析

3.1 ITS2序列特征分析

本研究统计了38 个居群清风藤属植物分子样进行PCR 扩增后的扩增成功率和测序成功率。结果显示，扩增成功率与测序成功率均为100%，表明本研究所选用的ITS2 序列引物在清风藤属植物中的通用性好。测序所得的序列经拼接、去除引物区和低质量序列，剪切两端5.8S和28S区，清风藤属植物的ITS2序列长度均为241 bp，GC 含量为51.9-64.7%。保守位点168 个，变异位点数目为73 个，简约信息位点数目为65 个。CpG、TpG（CpA）和 TpA 频率为 20.75%（50/241），2倍简并位点25个，4倍简并位点39个（图1）。

3.2 清风藤属ITS2序列种内和种间变异分析

应用MEGA 7.0 软件通过K2P 模型，统计清风藤属种间和种内遗传分化情况，获得的ITS2序列的种内与种间变异值详情见表2。ITS2 序列在清风藤属中，种内变异为0-0.074，其中种内变异最大的为S.swinhoei（0.074±0.002），S.campanulata与S.fasciculate种内遗传变异为0；种间变异在0.007-0. 205，其中S.discolor与S. swinhoei种间遗传距离最大，为 0.205 ±0.007，S.campanulata与S.transarisanensia种间遗传距离最小，为0.007。总体看，ITS2 序列在清风藤属内种间遗传距离与种内遗传距离存在一定间隔，可将各种类进行区分，是清风藤属植物较为理想的DNA条形码候选序列。

3.3 清风藤属ITS2序列系统进化树构建

应用ML，自展支持率（bootstrap）1000 次重复检验进行系统进化树构建（图2）。由ITS2 系统进化树可知：清风藤属厚盘组Sect.Pachydiscus下的四川清风藤、钟花清风藤亚种（鄂西清风藤）、云南清风藤、阿里山清风藤4 个种聚为1 支，组下的4 个种又各为单列，具有一定的遗传距离，能够较好的将清风藤属2 个组区分。其中，广布种四川清风藤由于采集地居群差异，具有较大的遗传距离，贵阳居群与其余居群区分，这与遗传距离分析结果一致。

清风藤组Sect.Sabia下的小花清风藤S.parviflora、簇花清风藤S. fasciculata样品较好的各自聚为一支，可与其余种类较好的区分。平伐清风藤S.dielsii与灰背清风藤S.discolor聚成一支，且灰背清风藤S.discolor2 个样品均镶嵌于平伐清风藤S.dielsii中，不宜区分。尖叶清风藤S. swinhoei样品均能聚为成一支，但各产地样品变异较大，不能聚类。可见，小花清风藤、簇花清风藤、云南清风藤、鄂西清风藤较为保守；平伐清风藤与灰背清风藤亲缘关系较近，但平伐清风藤与四川清风藤变异较为复杂。

4 讨论

清风藤属药用植物以茎叶及根入药，由于其特殊的药用功效多数种类在其产地均为药用，最早记载于宋代的《本草图经》，后《本草纲目》及贵州、湖南、广西等地的《天目山药用植物志》、《广西本草选编》等地方医药典籍与医药地方标准均有记载。又名“青藤、寻风藤”等，具有祛风利湿，活血解毒等功效。以小花清风藤药用最为广泛，在广西、贵州、云南、湖南、湖北等地均有药用，用于治疗和预防黄疸型传染性肝炎。现代研究表明，清风藤属植物具有良好的抗肝炎作用，有巨大的开发利用潜力。

目前，清风藤属植物及其药材的分类鉴定主要依赖于性状鉴别，显微方法等传统方法。由于其特殊的结构特性、遗传与分布特性，依靠标本难以对其进行分类鉴定，该属植物系统分类与鉴定还有待完善，尤其在清风藤药材的鉴定过程中应用传统分方法更难以区分。本研究对9 种清风藤属药用植物38 个居群核基因片段ITS2序列的结构、种间遗传距离与系统关系进行了分析。结果显示，ITS2 序列在清风藤属植物中的扩增率成功率与测序成功率均达到100%，引物通用性较好，较为容易得到质量较高的序列片段，具有较高的可行性。

表2 清风藤属植物ITS2序列种内和种间平均遗传距离

图2 基于ITS2构建的清风藤属药用植物ML系统进化树

分析获得清风藤属ITS2 序列保守位点168 个，变异位点数目73 个，简约信息位点数目65 个；其中，二倍简并位点25 个，四倍简并位点39 个。表明，ITS2 序列在清风藤属药用植物中具有较好的进化速率与变异程度，种间变异位点丰富，且种内变异位点较少。

ITS2 序列在清风藤属种内变异为0-0.074，种间变异为0.007-0.205，但从各种间遗传距离看，种间遗传距离均大于种内遗传距离，具有较好的种间分离度。从ITS2 构建的系统发育树结果看，在四川清风藤、尖叶清风藤、灰背清风藤等部分广布种中，存在属内种间遗传距离与种内遗传距离存在交叉，大多数种内具有稳定的遗传，近地理居群亲缘较近。系统树基本符合传统的系统分类学方法，清风藤组Sect.Sabia从清风藤属中区分聚为一个大支，包括于厚盘组Sect.Pachydiscus中，传统的分类方法将其单列，与清风藤组Sect.Sabia平行，有待进一步从基因组角度研究探讨。种间聚类情况与遗传距离分析结果一致，具有较好的种间分化。平伐清风藤为贵州特有植物，是典型的狭域分布种类，具有明显的区域分布特征，系统关系分析中，平伐清风藤与灰背清风藤亲缘关系较近，且平伐清风藤变异较为复杂，所有样品不能更好聚类。这提示平伐清风藤在可能是一个杂交形成物种，但还需结合形态特征，从多序列或基因组的角度进一步深入研究，予以证实。

综上，除平伐清风藤、灰背清风藤与广布种四川清风藤外，ITS2 序列基本能将属下物种进行区分。因此认为，ITS2 序列在清风藤属植物中具有适宜的分化和保守性，能够对种间进行较为准的分类和鉴别。研究中除阿里山清风藤外，均具有2个以上的产地样品，进行了反复验证，具有可重复性，符合清风藤属药用植物DNA条形码鉴定要求。因此，本研究中的ITS2序列适用于清风藤属药用植物的分类鉴定和系统学分析。本研究丰富了清风藤属药用植物的分子生物学研究数据，为该属植物的种类鉴定、物种起源、演化与系统学等研究提供了一定参考。