正骨水高效液相色谱指纹图谱*

范卫锋，胡琴，段婷婷，叶志文

(1.广西玉林制药集团有限责任公司，玉林 537001；2.广州康臣药物研究有限公司，广州 510530)

正骨水由徐长卿、两面针、降香、五味藤、薄荷脑、樟脑等26味中草药组成，具有活血祛瘀、舒筋活络、消肿止痛等药理作用，用于跌打扭伤以及体育运动前后消除疲劳[1]，也有文献报道正骨水治疗肩周炎、冻疮有效[2-3]。目前，采用气相色谱-质谱(GC-MS)分析正骨水的成分，鉴别出正骨水29 种成分[4]，而对于正骨水的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱研究笔者未见报道。中药指纹图谱能较好地反映中药及其制剂内在质量的均一性和稳定性，目前被国内外广泛接受和采纳作为质量控制手段之一[5-6]。笔者采用 HPLC 法对正骨水进行指纹图谱研究，为正骨水的质量控制提供更多的参考依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Synsv0000超纯水器(Millipore公司)；JP-060超声波清洗器(深圳市洁盟清洗设备有限公司)；BT 25S电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，感量：0.01 mg]。

1.2药品与试药 丹皮酚(批号：110708-200506)，4-甲氧基水杨醛(批号：110790-201404)，樟脑(批号：111749-200601)均购于中国食品药品检定研究院，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。19批正骨水，批号分别为213281(S1)，213286(S2)，213290(S3)，213291(S4)，213294(S5)，213305(S6)，213309(S7)，213321(S8)，213322(S9)，213324(S10)，213326(S11)，213327(S12)，1701002(S13)，1701003(S14)，1701004(S15)，1701005(S16)，1701006(S17)，1701008(S18)，1701010(S19)，由广西玉林制药集团有限责任公司提供。

2 方法与结果

2.1色谱条件 Agilent Extend-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)为流动相；梯度洗脱，0～15 min，5%→20%A；>15～45 min，20%→30%A；>45～75 min，30%→50%A；>75～90 min，50%→80%A；>90～110 min，80%→100%A，流速：1.0 mL·min-1，柱温：30 ℃，检测波长为280 nm。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 取丹皮酚、4-甲氧基水杨醛、樟脑对照品适量，精密称定，加甲醇制成1.998，2.016，99.7 mg·L-1溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备 精密量取正骨水100 μL，置10 mL量瓶中，加乙醇定容，摇匀即得。

2.3方法学考察

2.3.1精密度实验 取正骨水溶液(批号：213281)，按 “2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定连续进样6次，进样量5 μL。以丹皮酚色谱峰为参照，计算22个共有峰相对保留时间和相对峰面积，RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.3.2溶液稳定性实验 取正骨水溶液(批号：213281)，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8，12，24，48，72 h进样，进样5 μL，按“2.1”项下色谱条件测定。以徐长卿药材主要成分丹皮酚色谱峰为参照，计算22个共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，结果表明供试品溶液放置72 h 稳定。

2.3.3重复性实验 取正骨水溶液(批号：213281)，按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，制备 6 份供试品溶液，分别进样测定，进样5 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，以徐长卿药材主要成分丹皮酚色谱峰为参照，计算22个共有峰相对保留时间和相对峰面积，结果RSD均小于3%，表明方法重复性良好。

2.4指纹图谱的建立与分析

2.4.1指纹图谱的建立 取19批正骨水，按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，得到19批正骨水的 HPLC 指纹图谱，标记为S1～S19。见图1。

A.空白溶剂；B.对照品；C.正骨水；11.4-甲氧基水杨醛; 14.丹皮酚; 18.樟脑。

图1 正骨水和对照品的HPLC图

A. blank solivent;B.control solution;C.Zhenggushui;11.4-methoxysalicylaldehyde;14.paeonol;18.camphor

Fig.1 HPLC chromatogram ofZhenggushuiand control

表1 19批正骨水的相对保留时间

2.4.2参照峰的选择 丹皮酚为徐长卿的主要成分，其分离度好、出峰时间适中、峰面积较大且稳定、易于辨认，故选择其作为本品 HPLC 指纹图谱的参照峰。

2.4.3共有峰的标定 以14号(S)丹皮酚色谱峰为参照，计算样品的22 个共有峰的相对保留时间、相对峰面积值，共有指纹峰特征参数见表 1，2。

表2 19 批正骨水的相对峰面积

2.4.4指纹图谱的相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”2012 版(国家药典委员会)对 19 批正骨水进行相似度评价，指纹图谱叠加见图2，相似度评价结果见表3。S1～S19 相似度>0.90。

图2 19 批正骨水HPLC 指纹谱叠加

Fig.2 Overlay HPLC fingerprint of 19 batches ofZhenggushui

2.4.5各特征峰的药材归属 按正骨水制备方法制备徐长卿、两面针、降香、五味藤、香加皮、香樟、樟脑、21味药材蒸馏液，按“2.2.2”项方法，制成供试品溶液，再按“2.1”项色谱条件进样测定，记录色谱图，并与正骨水样品的指纹图谱进行比对，从而确认样品指纹图谱中各特征峰的归属，结果见表4。

2.4.6正骨水色谱数据的聚类分析 将各样品所得指纹图谱的 22 个共有峰峰面积相对于称样量量化，运用SPSS 20.0版软件对所有正骨水样品进行系统聚类分析。采用 Ward 法，采用平方Euclidean距离法，计算不同批号样品间相似程度，聚类分析结果见图3。19批正骨水样品大致分为 4 类：Ⅰ类包括批号为S1，S3，S4，S5，S6的样品，Ⅱ类包括批号为S7，S8，S9，S10，S11，S12的样品，Ⅲ类包括批号为S14，S15，S16，S17的样品，Ⅳ类包括批号为S13，S18，S19的样品；但整体而言，这19批正骨水样品均聚在同一类，产品相似度比较集中，质量差异性较小。聚类分析得到的样品之间的相关程度，与采用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”2012 版(国家药典委员会)计算样品间相似度的相关性比较，结果一致。

3 讨论

采用DAD 检测对正骨水供试品溶液在200～400 nm波长紫外吸收进行考察，重点考察210，254，280，310和365 nm共5个波长，结果表明在280 nm 波长下，色谱信息丰富，各成分均有较好地吸收，各色谱峰分布均匀，且峰形大小合适，基线较平稳，因而选择了280 nm作为检测波长。

表3 19批正骨水相似度评价

表4 指纹图谱中各特征峰的归属

Tab.4 Affiliation of characteristic peaks in fingerprints

药材峰号徐长卿14降香6,7,9,10,11,12,13,15, 16,17,19,20,21两面针1,3,4,5,8五味藤19药材峰号香加皮11香樟22樟脑1821味药材蒸馏液2,11,22

图3 聚类分析树状图

正骨水中九龙川、木香、海风藤等21味药材，置回流提取罐中，加入一定浓度乙醇，加热回流提取7 h后，进行蒸馏得到蒸馏液，进行液相色谱研究，得到色谱信息较少，正骨水HPLC指纹图谱得到主要色谱峰来自用于浸渍的具有祛瘀止痛功效的降香[7]、两面针[8-9]、徐长卿、五味藤、蒸馏提取的香加皮和香樟药材、加入的樟脑原料药。

运用指纹图谱技术可全面评价中药复方制剂内在质量，其具有整体性、直观性，相对于以单一对照品而言，其提供的信息更全面，更有价值[10-11]。本实验对19批正骨水进行HPLC指纹图谱的研究，标定22个共有峰，并指认了3个成分峰，确认14号峰为丹皮酚(徐长卿中主要成分[12])，11号峰为4-甲氧基水杨醛(香加皮中主要成分)，确认18号峰为樟脑(樟脑原料)，19批正骨水的相似度均>0.9，并对共有峰进行归属，结果表明各样品的指纹图谱主要峰整体一致，该法可作为正骨水质量控制方法之一。