JAK2II型抑制剂CHZ868的合成

周韵秀,宋明辉,王小龙,于海涛

(南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210046)

JAK2激酶是治疗骨髓增殖性肿瘤(MPN)和B细胞急性淋巴白血病(B-ALL)的重要靶标，瑞士诺华制药有限公司在研究JAK2Ⅱ型激酶抑制剂的结构时，发现 CHZ868能够通过抑制JAK2-STAT信号通路的异常激活治疗MPN和B-ALL[1-13]。

目前，CHZ868的合成报道较少。2005年Okaniwa等[14]在专利中提供了一种芳基-苯并咪唑的合成方法，以4-氨基-3-硝基苯酚为起始原料，将氨基甲基化后，成醚再霍夫曼降解得到芳氧基吡啶-2-胺类化合物，乙酰化和还原硝基后通过芳基异氰酸酯构建苯并咪唑环得到CHZ868类似物。该路线反应选择性较差，副产物多，后处理较繁琐。2018年，龚顶等[15]以3-甲基-2-硝基苯胺为起始原料，在4-位选择性引入羟基，并将氨基甲基化后成醚，接着通过霍夫曼降解得到2-氨基吡啶类化合物，再经乙酰化、脱保护还原硝基得到关键中间体，最后与硫代异氰酸酯反应构建苯并咪唑得到最终产物CHZ868。该方法原材料原料较贵，反应温度较高，反应时间偏长。

为优化CHZ868的合成路线，本文以1-硝基-3-甲氧基甲苯为原料，经硝基还原后乙酰化，引入硝基，脱乙酰基后氨基用Boc保护，将硝基转化成甲氨基得到化合物4，再和异硫氰酸酯5构建苯并咪唑环从而合成化合物6，脱甲基后再通过亲核取代成醚连接吡啶部分，最后通过保护基保护氨基提高选择性，将伯氨进行乙酰化得到CHZ868(Scheme 1)，总收率6.24%,其结构经1H NMR,13C NMR和LC-MS确证。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker AV 500 MHz型核磁共振仪(DMSO-d6或CDCl3为溶剂,TMS为内标);Thermo ScientificTMQ ExactiveTMFocus 型四极杆-轨道阱质谱仪；Agilent 1100型高效液相色谱仪;Shimadzu-8A型高效液相色谱仪。

所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) 1-甲氧基-2-甲基-3-氨基(2)的合成

氩气保护下，向三颈瓶中依次加入化合物133.0 g(197.4 mmol)，活性炭3.3 g(10wt%)，三氯化铁33.2 g(19.74 mmol)和95%乙醇350 mL，升温至35 ℃(浴温)，缓慢滴加50%水合肼98.7 g(987 mmol)，滴毕，保温50 min；加热至45 ℃，反应2 h。冷却至室温，过滤，滤液浓缩，残余物用乙酸乙酯(3×200 mL)萃取，合并有机相，依次用饱和食盐水(3×200 mL)洗涤，真空干燥，浓缩得红棕色油状液体A。

将A,三乙胺79.9 g(789.6 mmol)和二氯甲烷250 mL搅拌均匀，冰浴保持0 ℃，滴加醋酸酐100.8 g(987.0 mmol)的二氯甲烷(150 ml)溶液，滴毕(50 min)，搅拌30 min;升至室温，搅拌下反应8 h。用冰水(约300 mL)淬灭反应，分液，用DCM(3×150 mL)萃取水相，合并有机相，用饱和食盐水(3×200 mL)洗涤，真空干燥，浓缩得白色固体B。

将B和醋酸酐 500 mL加入反应瓶中，搅拌使其形成混悬液，冰盐浴冷却(-10 ℃)，滴加发烟硝酸18.7 g(296.1 mmol),滴毕(40 min)，搅拌反应15 min。滴加至冰水(约500 g)中，用氢氧化钠溶液调至pH 7～ 8，用二氯甲烷(3×500 mL)萃取，合并有机相，依次用饱和食盐水(3×500 mL)洗涤，真空干燥，浓缩得黄棕色固体C。

将C和6.0 M浓盐酸480 mL加入反应中，搅拌下升温至115 ℃，反应2 h。冰水冷却，用氢氧化钠溶液调至pH 8～9，用二氯甲烷(3×400 mL)萃取，合并有机物，用饱和食盐水(3×400 mL)洗涤，真空干燥，浓缩，残余物经硅胶柱层析[洗脱剂：A=V(石油醚)/V(乙酸乙酯)/V(二氯甲烷)=20/1/1～20/4/1]纯化得黄色针状固体215.8 g，产率43.9%;1H NMR(CDCl3,500 MHz)δ:8.08(d,J=9.6 Hz,1H,ArH),6.35(d,J=9.6 Hz,1H,ArH),6.19(s,2H,NH2),3.89(s,3H,OCH3),2.05(s,3H,CH3);13C NMR(CDCl3,500 MHz)δ:162.20,144.92,127.83,126.03,110.04,101.18,56.08,8.95。

(2) 3-甲基-4-甲氧基-2-[双[((1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]硝基苯(3)的合成

在圆底烧瓶中加入化合物215.8 g(86.73 mmol)，二碳酸二叔丁酯47.3 g(216.83 mmol)，4-二甲氨基吡啶21.2 g(173.46 mmol)和四氢呋喃240 mL，加热至75 ℃，反应2 h。冷却至室温，加入冰水300 mL，用乙酸乙酯(3×200 mL)萃取，合并有机相，依次用饱和食盐水(3×300 mL)洗涤，真空干燥，浓缩，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：A=20/1/1～15/5/1)纯化得亮黄色固体333.0 g，产率99.5%;1H NMR(CDCl3,500 MHz)δ:8.03(d,J=9.1 Hz,1H,ArH),6.86(d,J=9.1 Hz,1H,ArH),3.93(s,3H,OCH3),2.12(s,3H,CH3),1.38(s,18H,Boc-H);13C NMR(CDCl3,125 MHz)δ:161.85,150.19,139.35,133.63,127.55,124.58,108.63,83.36,56.26,27.88,10.65;LC-MSm/z:Calcd for C18H26N2O7{[M+Na]+}405.1632,found 405.1628。

(3) 3-甲基-4-甲氧基-2-[双((1,1-二甲基乙氧基)羰基)氨基]苯胺(4)的合成

在圆底烧瓶中加入化合物333.0 g(86.29 mmol)，钯/碳3.3 g(10wt%)和甲醇330 mL，氢气氛围，搅拌下反应48 h。过滤，滤液浓缩，残余物加入甲酸2.1 mL和甲酸乙酯213 mL，搅拌使其混合均匀，加热至60 ℃反应3 h；浓缩，残余物溶于340 mL无水四氢呋喃中，氩气保护，滴加1.0 M硼烷-四氢呋喃溶液260 mL(260 mmol)，滴毕(80 min),搅拌下于0 ℃反应8 h。滴加甲醇约45 mL，滴毕搅拌15 min；加入冰水约200 mL和1.0 M氢氧化钠25 mL，用乙酸乙酯(3×150 mL)萃取，合并有机相，依次用饱和食盐水(3×150 mL)洗涤，真空干燥，浓缩，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：A=20/1/1～15/5/1)纯化得黄棕色固体427.6 g，产率86.84%;1H NMR(CDCl3,500 MHz)δ:6.78(d,J=8.8 Hz,1H,ArH),6.75(d,J=9.0 Hz,1H,ArH),6.45(d,J=8.8 Hz,1H,NH),3.76(s,3H,OCH3),2.79(s,3H，NCH3),2.04(s,3H,CH3),1.39(s,18H,Boc-H);13C NMR(CDCl3,125 MHz)δ151.76,149.80,140.17,125.98,125.42,111.76,108.00,82.49,56.57,31.33,27.94,10.72;HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C19H30N2O5{[M+H]+}367.2226，found 367.2227。

(4) 4-甲氧基-N,1,3-二甲基苯-1,2-二胺三盐酸盐(6)的合成

在圆底烧瓶中加入化合物427.6 g(75.32 mmol)和乙酸乙酯500 mL，滴加盐酸的1,4-二氧六环(30 mL)溶液，搅拌下反应16 h。过滤，滤饼溶于40 mL二甲基亚砜中，一次性加入碳酸钾3.5 g(25.0 mmol)，于20 ℃搅拌30 min；冷却至15 ℃，在2 h内滴加51.9 g(10.8 mmol)的二甲基亚砜(28 mL)溶液，搅拌下于15～ 20 ℃保温反应1.5 h。依次加入碳酸钾3.1 g(22.0 mmol)和碘2.6 g(10.0 mmol)，加热至45 ℃保温4 h；加热至80 ℃，反应8 h。冷却至室温，倒入冰水(约150 mL)中，用二氯甲烷(3×80 mL)萃取，合并有机相，依次用饱和硫代硫酸钠(2×50 mL)和饱和食盐水(2×50 mL)洗涤，真空干燥，浓缩，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：A=10/1/1～15/5/1)纯化得淡粉色固体62.5 g，产率81.1%;1H NMR(DMSO-d6,500 MHz)δ:8.52(s,1H,NH),8.12～8.07(m,1H，F-ArH),7.31(t,J=10.2 Hz,1H,F-ArH),7.09(t,J=8.9 Hz,1H,F-ArH),7.04(d,J=8.9 Hz,1H,ArH),6.74(d,J=8.5 Hz,1H,ArH),3.76(s,3H,OCH3),3.63(s,3H,NCH3),2.26(s,3H,Ph-CH3);13C NMR(DMSO-d6,125 MHz)δ:158.03,156.36,154.72,152.44,150.93,141.46,129.21,125.70,123.33,113.33,111.05,111.02,110.88,110.85,104.86,104.62,104.20,104.01,103.98,103.79,56.33,29.05,10.10;HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C16H15N3OF2{[M+H]+}304.1252,found 304.1256。

(5) 2-((2,4-二氟苯基)氨基)-1,4-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-醇(7)的合成

在圆底烧瓶中加入61.0 g(3.3 mmol)，氢溴酸吡啶盐1.6 g(9.9 mmol)和氯化钠2.0 g,搅拌下于250 ℃反应15 min。冷却至室温，用乙酸乙酯100 mL洗涤，过滤，滤液浓缩，残余物真空干燥得深色油状液体，经硅胶柱层析[洗脱剂：B=V(二氯甲烷)/V(甲醇)=100/1～20/1]纯化得淡黄色固体7859 mg，产率89.9%；1H NMR(DMSO-d6,500 MHz)δ:8.55(s,1H,NH),8.41(s,1H,OH),8.08(td,J=9.3 Hz,6.1 Hz,1H,F-ArH),7.30(ddd,J=11.7 Hz,8.9 Hz,2.9 Hz,1H,F-ArH),7.07(dq,J=9.3 Hz,4.6 Hz,2.8 Hz,1H,F-ArH),6.89(d,J=8.4 Hz,1H,ArH),6.58(d,J=8.4 Hz,1H,ArH),3.59(s,3H，N-CH3),2.22(s,3H,Ph-CH3);13C NMR(DMSO-d6,125 MHz)δ:150.16,149.87,141.52,127.76,125.99,125.90,122.82,122.81,122.76,122.74,111.35,111.02,110.99,110.84,110.81,108.30,104.91,104.14,103.95,103.93,103.74,28.99,10.18;HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C15H13N3OF2{[M+H]+}290.1099，found 290.1099。

(6) (2,4-二氟苯基)-1,4-二甲基-5-((2-硝基吡啶-4-基)氧基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(9)的合成

在圆底烧瓶中加入7599 mg(2 mmol)的无水DMF(15 mL)溶液，分两次加入碳酸钾415 mg(3 mmol)，搅拌15 min；于66 ℃滴加8317 mg(1.0 mmol)的无水DMF(15 mL)溶液，滴毕(3 h)，搅拌1 h；加热至80 ℃，反应7 h。冷却至室温，倒入冰水(约100 mL)中，用10%异丙醇的二氯甲烷溶液(3×50 mL)萃取，合并有机相，用饱和食盐水(3×50 mL)洗涤，真空干燥，浓缩，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：A=10/1/0～15/5/1)纯化得黄色固体9288 mg，产率35%；1H NMR(DMSO-d6,500 MHz)δ:8.72(s,1H,NH),8.49(d,J=5.6 Hz,1H,Pyr-H),8.05(td,J=9.1 Hz,6.0 Hz,1H,F-ArH),7.55(d,J=2.4 Hz,1H,Pyr-H),7.37～7.31(m,1H,F-ArH),7.30～7.25(m,1H，,Pyr-H),7.28(d,J=8.5 Hz,1H,ArH),7.10(td,J=8.8 Hz,2.8 Hz,1H,F-ArH),6.90(d,J=8.5 Hz,1H,ArH),3.73(s,3H，N-CH3),2.18(s,3H,Ph-CH3);13C NMR(DMSO-d6,125 MHz)δ:167.95,158.61,158.52,158.32,156.69,156.59,154.95,154.85,152.98,152.88,151.88,145.17,141.79,132.45,125.19,125.10,124.34,124.26,117.71,116.50,112.72,111.16,111.13,110.98,110.95,106.78,104.79,104.32,104.13,104.11,103.92,29.26,10.19;HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C20H15N5O3F2{[M+H]+}412.1212，found 412.1216。

(7) 5-((2-氨基吡啶-4-基)氧基)-N-(2,4-二氟苯基)-1,4-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(10)的合成

氩气保护下，在圆底烧瓶中加入化合物9165 mg(0.40 mmol)，活性炭16.5 g(10wt%)，三氯化铁7 mg(0.04 mmol)和95%乙醇5 mL，于30 ℃搅拌均匀；滴加50%水合肼1.0 mL(10 mmol)，滴毕，加热至50 ℃，反应2 h。冷却至室温，过滤,滤液浓缩，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：A=10/1/1～10/5/1)纯化得淡黄色固体10153 mg，产率99.9%;1H NMR(DMSO-d6,500 MHz)δ:8.63(s,1H,NH),8.05(td,J=9.3 Hz,6.0 Hz,1H,F-ArH),7.74(d,J=5.8 Hz,1H,Pyr-H),7.33(ddd,J=11.6 Hz,8.9 Hz,2.9 Hz,1H,F-ArH),7.20(d,J=8.4 Hz,1H,ArH),7.10(t,J=8.7 Hz,1H,F-ArH),6.78(d,J=8.4 Hz,1H,ArH),6.09(dd,J=5.8 Hz,2.2 Hz,1H,Pyr-H),5.80(s,2H,NH2),5.64(d,J=2.3 Hz,1H,Pyr-H),3.70(s,3H,N-CH3),2.17(s,3H,Ph-CH3);13C NMR(DMSO-d6,125 MHz)δ:166.24,161.56,159.96,158.64,158.47,156.28,156.16,154.97,154.85,152.53,152.41,151.37,149.16,145.85,141.53,131.75,123.84,118.15,113.60,111.18,111.14,110.96,110.93,106.25,104.35,104.11,104.08,103.84,101.42,92.40,29.17,10.29;HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C20H17N5OF2{[M+H]+}382.1472,found 382.1474。

(8) 叔丁基(4-((2-(((苄氧基)羰基)(2,4-二氟苯基)氨基)-1,4-二甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)氧基)吡啶2-氨基)(三苯甲基)氨基甲酸酯(11)的合成

冰水浴冷却，在圆底烧瓶中加入1040 mg(0.11 mmol)，三乙胺21 mg(0.21 mmol)和二氯甲烷3 mL，搅拌下在15 min内分两批加入三苯甲基氯44 mg(0.16 mmol)，逐渐升温至室温，反应16 h。倒入冰水(5 mL)中，用二氯甲烷(3×5 mL)萃取，合并有机相，依次用饱和食盐水(3×5 mL)洗涤，真空干燥，浓缩得到棕色固体D。

冰水浴冷却，在圆底烧瓶中加入D，三乙胺21 mg(0.21 mmol)和二氯甲烷3 mL，搅拌下在15 min内分批加入二碳酸二叔丁酯44 mg(0.16 mmol)，逐渐升温至室温，搅拌下反应16 h。倒入冰水(5 mL)中，用二氯甲烷(3×5 mL3)萃取，合并有机相，依次用饱和食盐水(3×10 mL)洗涤，真空干燥，浓缩，残余物溶于无水DMF 10 mL中，分两次加入氢化钠10 mg(0.25 mmol)，搅拌30 min；滴加苄氧基碳酰氯43 mg(0.25 mmol)，搅拌下反应16 h。倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(3×5 mL)萃取，合并有机相，依次用饱和食盐水(3×10 mL)洗涤，真空干燥，浓缩得黄色固体11。

(9) CHZ868的合成

冰水浴冷却，在圆底烧瓶中加入11的二氯甲烷(10 mL)溶液，滴加三氟乙酸2.5 mL,滴毕，搅拌下反应2 h。逐渐升温至室温，搅拌下反应4 h。倒入冰水(10 mL)中，用氢氧化钠溶液调至pH 8，用二氯甲烷(3×10 mL)萃取，合并有机相，依次用饱和食盐水(3×10 mL)洗涤，真空干燥，浓缩，残余物加入三乙胺83 μL(0.60 mmol)和二氯甲烷(5 mL)中，滴加醋酸酐47 μL(0.50 mmol),滴毕，加热至40 ℃，搅拌下反应24 h。倒入冰水(约10 g)中，用二氯甲烷(3×10 mL)萃取，合并有机相，依次用饱和食盐水(3×10 mL)洗涤，真空干燥，浓缩得黄色固体E。

在圆底烧瓶中加入E，10%钯碳6.2 g(10wt%)和甲醇8 mL，氢气氛围，反应16 h。过滤，滤液浓缩，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂B：100/1～100/3)纯化得白色固体CHZ868 26 mg，总产率40.67%;1H NMR(DMSO-d6,500 MHz)δ:10.47(s,1H,AcN-H),8.68(s,1H,NH),8.11(d,J=5.7 Hz,1H,Pyr-H),8.06(td,J=9.1 Hz,5.7 Hz,1H,F-ArH),7.54(d,J=2.4 Hz,1H,Pyr-H),7.35(ddd,J=11.6 Hz,8.9 Hz,2.9 Hz,1H,F-ArH),7.22(d,J=8.4 Hz,1H,ArH),7.16～ 7.08(m,1H,F-ArH),6.81(d,J=8.4 Hz,1H,ArH),6.53(dd,J=5.7 Hz,2.4 Hz,1H,Pyr-H),3.72(s,3H,NCH3),2.16(s,3H,Ph-CH3),2.00(s,3H,Ac-H);13C NMR(DMSO-d6,125 MHz)δ:169.30,166.54,153.86,151.54,149.27,145.69,141.57,132.04,131.94，125.39,125.36,125.26,125.21,124.11,124.09,124.02,124.00,117.93,113.30,111.20,111.17,110.99,107.05,106.41,104.38,104.15,104.12,103.88,99.62,31.32,23.88,10.31。

在本文设计的CHZ868合成路线中，总步骤有19步，其中仅9步需要柱层析纯化，有12步反应温度为0 ℃或室温。

在合成路线的开发过程中，发现了一些有趣的现象：在将化合物1中的硝基官能团还原为氨基时，分别尝试多种还原条件，例如，使用Pd/C(10%)催化氢化时,反应速度缓慢，若反应时间不充分会停留在中间体状态，历时4 d终产物的转化率也不到50%，而使用HCl/Fe或HCl/SnCl2等体系还原时，产率最高不超过80%。只有使用水合肼作为氢源，产率较高(99%)。

合成化合物3时，由于乙酰氨基和甲氧基都是供电子基团，导致4,6-位都有可能被硝化，且硝酸过量会导致二硝化产物生成，当量使用硝酸又会导致原料转化率降低。通过调整反应温度为-10 ℃左右，4-位硝化的目标产物产率可达95%。虽然依旧生成了些杂质，但是不影响下一步还原后产物的分离纯化，所以硝化反应可以和还原反应两步合并后纯化。

将化合物3中的硝基官能团还原成氨基时，发现Pd/C催化，常压氢气氛围中还原反应产率达到99%，产物纯净，其他还原条件在进行mg级别反应时和Pd催化还原差异较小，但是在进行大于10 g规模的反应时，HCl/Fe、HCl/SnCl2以及水合肼/FeCl3体系都会产生大量中间体，难以判断反应是否进行彻底。

合成化合物6时，尝试使用异氰酸酯进行闭环，非闭环产物较多，产率不超过40%，且在文献[16]条件下产率高于80%。在化合物6进行脱酚甲基反应时，使用文献方法[17-21]，如常规的BBr3作为脱甲基试剂，反应结果尚可接受，但是在后处理时出现了大量黏稠物，且原料发烟强烈。

合成化合物7时，则必须用4-氯-2-硝基吡啶(8)，若使用4-氯-2-氨基吡啶作为原料，芳香亲核取代几乎不能发生。在最后进行化合物10的乙酰化反应时，我们发现吡啶环上伯氨基的亲核能力不如另外一种仲胺，导致绝大多数产物都是仲胺乙酰化产物以及二乙酰化产物，只有极少量目标化合物CHZ868。因此，选择大位阻保护基三苯甲基(Trt)和叔丁氧羰基(Boc)先保护伯氨基，再用苄氧羰基(Cbz)保护仲胺基，在三氟乙酸条件下脱除Trt和Boc后进行乙酰化，再催化氢化脱去Cbz到目标终产物CHZ868。

采用廉价易得的1-硝基-3-甲氧基甲苯为原料，经常规反应合成了JAK2II型抑制剂CHZ868。虽然反应步骤较多，路线较长，但是尽量避开了高价、高毒、高危的反应条件，且绝大多数步骤后处理简单，具有一定的应用价值。