CML促进高脂诱导糖尿病ApoE-/-小鼠非酒性脂肪肝进展的研究

(江苏大学附属医院 1.心内科，2.病理科，江苏 镇江 212001)

糖尿病是危害人类健康的全球性疾病，预计到2030年患病人数将超过5.5亿[1-2]。研究发现糖尿病与非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的发生密切相关。已知在一般人群中，NAFLD患病率在13%～15%之间，而糖尿病NAFLD的患病率则迅猛增加至70%[3-5]，研究糖尿病NAFLD发病机制意义重大。AGEs是糖毒性的关键代谢产物，在糖尿病相关并发症中作用显著[6-7]；但AGEs在其重要代谢器官肝脏NAFLD发病中的作用尚不明晰。因此，我们拟通过体外、体内实验探讨AGEs关键活性成分Nε-羧甲基赖氨酸(Nε-carboxymethyl-Lysine，CML)在糖尿病性非酒性脂肪肝中的作用，以期为防治非酒精性脂肪提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料

HepG2购自中国科学院上海细胞库；CML购自Toronto公司；油酸、棕榈酸购自Sigma公司；高糖DMEM培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自维森特公司；总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒购自南京建成生物公司；兔/鼠通用型Streptavidin-HRP试剂盒购自康为世纪公司。

1.2 细胞培养与分组

HepG2细胞在高糖DMEM培养基含10%FBS和1%青霉素-链霉素溶液，温度为37 ℃、含5%CO2环境下培养，待细胞成片生长至融合状态时，根据实验目前其分组如下：对照组(10%FBS高糖DMEM)，FFA组(10%FBS高糖DMEM+0.5 mmol/L FFA)，CML低剂量组(10% FBS高糖DMEM+0.5 mmol/L FFA+10 μmol/L CML)，CML高剂量组(10% FBS高糖DMEM+0.5 mmol/L FFA+100 μmol/L CML)。干预24h后进行油红O染色以及油红萃取实验。

1.3 油红染色以及油红萃取实验

将HepG2细胞以1×105每孔种于6孔板中诱导24 h后，PBS润洗2遍，用60%异丙醇将每个孔润洗一遍，每孔加入1 mL油红O染色液，染色15 min后，使用60%异丙醇再次润洗一遍，使用苏木素染色1 min，置于显微镜下观察。每孔加入1 mL异丙醇萃取细胞内的油红O染色液，每孔100 μL加入96孔板中，于510 nm处测定其吸光度。

1.4 动物模型建立及分组

6周龄ApoE-/-雄性小鼠购自北京大学实验室。ApoE-/-小鼠予腹腔注射链脲佐菌素40 mg/kg/d连续注射5天。2周后将血糖水平≥300 mg/dL的小鼠纳入本研究。20只6周龄ApoE-/-小鼠随机分为4个实验组，对照组(普食+尾静脉注射生理盐水，n=5)，模型组(高脂饮食+尾静脉注射生理盐水，n=5)，CML低剂量组(高脂饮食+尾静脉注射CML5mg/kg/day，n=5)，CML高剂量组(高脂饮食+尾静脉注射CML 10 mg/kg/day，n=5)喂养8周。实验结束后，小鼠眼球摘除眶后取血，用于检测相关指标。剥离出肝脏组织，多聚甲醛固定肝脏组织并进行组织石蜡切片。

1.5 血清学检测

小鼠进行眶后取血后，室温静置1h后，收集上层血清，使用相关试剂盒检测相关指标包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)按照试剂盒说明书操作。

1.6 肝脏HE染色

采用常规HE染色法，以4%的多聚甲醛固定，制备石蜡包片，连续切片，HE染色，显微镜下观察肝脏脂肪变性。

1.7 免疫组织化学染色

石蜡切片进行常规脱蜡水化、抗原修复后。按照兔/鼠通用型Streptavidin-HRP试剂盒说明书进行CML免疫组化染色，显微镜下观察，并通过Image J进行统计定量。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 CML促进HepG2细胞内脂质蓄积

通过油红O染色检测细胞内脂质蓄积情况(如图1)，与对照组相比，FFA组脂滴数目增加(如图1A、1B)，加入不同浓度CML后，显著增加了细胞内脂滴的数量(如图1C、D)。

2.2 肝组织中CML的累积

为进一步验证CML是否累积在肝组织中，我们通过CML免疫组织化学染色，检测肝脏中CML含量(如图2)，我们发现相比对照组，HFD组CML染色强度稍增强，随着小鼠尾静脉CML给药浓度的增加，肝脏内CML染色强度逐渐增强。

图1 CML对FFA诱导的HepG2细胞脂质蓄积油红O染色(400×)A：对照组；B：FFA组；C：CML低剂量组；D：CML高剂量组与对照组比较，*P<0.05，与FFA组比较,#P<0.05，与CML低剂量组相比，▲P<0.05(n=3)

图2 免疫组织化学检测小鼠肝脏CML含量累积图片(400×)A：对照组；B：FFA组；C：CML低剂量组；D：CML高剂量组与对照组比较，*P<0.05，与HFD组比较,#P<0.05，与CML低剂量组相比，▲P<0.05

2.2 CML促进高脂喂养ApoE-/-小鼠脂代谢紊乱

通过细胞实验我们发现CML加重FFA诱导的HepG2细胞内脂质的蓄积。与此同时，我们在体内实验上，我们发现HFD组小鼠血清中TC，TG水平明显升高，CML处理后小鼠血清中TC，TG水平进一步升高。并且这种改变与CML浓度变化相关(如图3)。

图3 CML促进高脂喂养ApoE-/-小鼠脂代谢紊乱(n=5)ApoE-/-小鼠连续喂养8周，实验结束后ApoE-/-小鼠眶后取血，检测血脂(TC、TG)水平。与对照组比较，*P<0.05，与HFD组比较，#P<0.05，与CML低剂量组相比，▲P<0.05

2.3 CML加重高脂饮食的ApoE-/-小鼠肝脏损伤以及肝脏脂肪样变

与对照组相比，HFD组血清中ALT、ALT活性升高，CML处理后血清中AST、ALT活性明显升高，进一步加重肝脏损伤(图4)肝脏HE染色显示对照组肝叶结构清晰，形态正常，肝细胞成放射状分布，与对照组相比HFD组肝叶紊乱，可见空泡样结构，CML组与HFD组相比肝叶结构辨认不清，肝细胞内可见融合成片的空泡样结构(如图5)。

图4 CML浓度依赖性促进高脂喂养APOE-/-小鼠肝脏损伤(n=5)ApoE-/-小鼠连续喂养8周，实验结束后小鼠眶后取血，检测肝酶(AST、ALT)水平。与对照组比较，*P<0.05，与HFD组比较，#P<0.05，与CML低剂量组相比，▲P<0.05

图5 CML浓度依赖性促进高脂喂养ApoE-/-小鼠肝脏脂肪变性肝脏组织HE染色(200×)观察肝脏病理变化A：对照组；B：HFD组；C：CML低剂量组；D：CML高剂量组

2.4 CML加重高脂喂养ApoE-/-小鼠肝组织内氧化损伤

与对照组比较，HFD组小鼠肝组织中SOD、GSH-Px含量显著减低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)；与HFD组比较，CML组肝组织中SOD及GSH-Px含量进一步降低(P<0.05)，MDA含量进一步升高(P<0.05)(如图6)。

图6 CML浓度依赖性促进高脂喂养ApoE-/-小鼠肝组织内氧化损伤(n=5)ApoE-/-小鼠连续喂养8周，实验结束后小鼠眶后取血，检测SOD、GSH-Px、MDA水平。与对照组比较，*P<0.05，与HFD组比较，#P<0.05，与CML低剂量组相比，▲P<0.05

3 讨 论

糖尿病患者多合并NAFLD发生[8]，但由于早期症状体征不明显往往不易察觉，即使患者确诊合并NAFLD的发生，但是部分患者肝酶水平未见明显异常，因此往往造成患者漏诊[9]。糖尿病合并NAFLD发生的患者，其心血管疾病的患病风险明显增加，严重影响患者生活质量。[10-11]

NAFLD是以肝脏细胞空泡性、弥漫性样变为主要病理表现的肝脏疾病。近年来NAFLD的患病率不断上升，据统计在西方国家多达30%的成年人患有NAFLD[12]。而NAFLD的发病机制复杂，目前尚不清楚。“二次打击”是目前学术界普遍接受NAFLD发病机制假说。其中第一次打击主要包括肝脏内脂质的累积，第二次打击主要是在脂质过量累积的基础上肝细胞的氧化损伤。氧化损伤在NAFLD形成中发挥重要作用，因此抑制氧化损伤也是防治NAFLD的重要途径。

为探究CML在糖尿病性非酒性脂肪肝中的作用。我们用HepG2建立体外模型，研究发现CML加重FFA诱导HepG2细胞内脂质的蓄积，并且这种作用依赖于CML浓度变化。为进一步探究CML如何促进NAFLD形成。我们以ApoE-/-小鼠构建体内模型，在体内模型中我们发现CML可明显加重高脂诱导ApoE-/-小鼠血清TC、TG水平，肝脏HE显示CML作用下肝脏组织可见大量空泡样结构。CML刺激下ApoE-/-小鼠血清中AST、ALT水平明显增加。氧化损伤反应是NAFLD重要的发病机制之一，GSH-Px以及SOD可效清除肝组织内的自由基的产生，减少氧化损伤，是肝组织内抑制氧化损伤反应的重要组成部分[13]。而MDA作为一种强毒力的脂质过氧化产物，其水平能反映氧化损伤程度，参与NAFLD的进展[14]。为探究CML是否通过加重氧化损伤促进NAFLD的形成。我们检测了血清中SOD、MDA、GSH-Px水平。结果显示，CML明显上调MDA的表达，抑制SOD、GSH-Px的表达。

我们通过体外、体内实验证明了CML通过促进脂质累积、加重氧化损伤进而促进NAFLD的形成。CML可能作为糖尿病患者NAFLD形成的危险因素,这为糖尿病患者早期预防非酒精性脂肪肝的形成提供了新策略。