炎症反应及细胞内钙浓度异常升高在脓毒症发展中的作用分析

(商洛市中心医院急诊科，陕西 商洛726000)

脓毒症及并发休克是目前ICU患者的主要死亡原因之一[1]。感染引发的免疫反应将炎症因子作用于血管内皮细胞，导致血管内皮细胞功能受损是脓毒症的病理基础[2]。同时病原菌入侵机体释放的内毒素引发血管内皮细胞中钙浓度异常升高(钙超载)，导致血管内皮屏障功能受损，通透性增加，炎症因子和病原菌可进入组织间隙，引发全身性炎症反应[3]。脂多糖活化Toll样受体4(Toll-like receptor4,Tlr4)激活肿瘤坏死因子相关受体，活化核转录因子-κB(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)，诱发炎性介质的分泌与释放是细菌内毒素引发炎症反应的经典信号通路[4]。目前关于脂多糖诱导的细胞钙超载机制尚未明确；作为体内主要的第二信使，钙离子的产生、流动与L型钙通道、ATP酶等多种分子通路有关[5]，但脂多糖诱导的Tlr4活化与细胞内外钙流动相关的信号通路仍未阐明。相关研究显示，细菌内毒素能够活化血管内皮细胞表面的Tlr4和髓质分化蛋白2复合物[6]；基质相互作用分子1(Recombinant Human Stromal Interaction Molecule 1,Stim1)是细胞内质网表面的钙离子感受器，活化后的Stim1可激活细胞膜上的钙池调控钙离子通道，引发细胞外钙离子内流[7]。本研究使用脂多糖在体外诱导人脐静脉内皮细胞，构建血管内皮细胞损伤模型，分析细胞损伤过程中Tlr4、髓质分化蛋白2、NF-κB、Stim1、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、TNF-α的表达变化，旨在探讨炎症反应及细胞内钙浓度异常升高在脓毒症发展过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人脐静脉内皮细胞购于上海斯信生物科技有限公司；Stim1抑制表达载体、Tlr4抑制表达载体由上海权阳生物科技有限公司构建；脂多糖、钙离子荧光探针、NF-κB抑制剂PDTC购于海德创业(北京)生物科技有限公司；鼠抗人Stim1、髓质分化蛋白2、NF-κB、GAPDH单克隆抗体，山羊抗鼠IgG购于艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞中Tlr4、髓质分化蛋白2、NF-κB mRNA表达水平检测 使用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养人脐静脉内皮细胞，传至5代后取对数生长期细胞，使用浓度为1 mg/L的脂多糖刺激细胞，使用RT-PCR检测脂多糖刺激前和刺激后1h、2h、6h、12h、24h的Tlr4、髓质分化蛋白2、NF-κB mRNA的表达水平，引物序列由上海权阳生物科技有限公司合成；基质相互作用蛋白1由上海百力格生物技术有限公司完成，其中Tlr4上游：5′-AGGACACA CTTTAACAATAGGCGA-3′，下游：5′-GCAATGCGATTGATACTCCC-3′；髓质分化蛋白2上游：5′-GTGGTTTGCACCGA ACGG TCG GG-3′，下游：5′-GGAGACTG TGTACGTCGT TAG GCG-3′；NF-κB上游：5′-TGTTAAGGCGTCG AAAA TCT-3′，下游：5′-CTATGTAACTACTCAAACCT-3′；GAPDH上游：5′-GTAG AGGTGAG TCGTTCTCCG ACC-3′，下游：5′-GAGGTTAGTTCCAACAG CCGAA-3′。反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，共40个循环，延伸72 ℃ 30 s。扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，计算Stim1、髓质分化蛋白2、NF-κB mRNA的相对表达量。

1.2.2 Stim1对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞钙流动的检测 人脐静脉内皮细胞接种于6孔板中常规培养12 h后分为空白对照组、脂多糖组、Stim1抑制表达载体转染组、Stim1抑制表达载体+脂多糖组，转染2 h，加入钙离子荧光探针室温下反应30 min，脂多糖刺激人脐静脉内皮细胞，激光共聚焦显微镜检测细胞中钙离子浓度变化。

1.2.3 Tlr4对人脐静脉内皮细胞中钙超载的影响

人脐静脉内皮细胞接种于6孔板中常规培养12 h后，分为空白对照组、脂多糖组、Tlr4抑制表达载体转染组、Tlr4抑制表达载体+脂多糖组、Tlr4及Stim1抑制表达载体+脂多糖组，转染2 h，加入钙离子荧光探针室温下反应30 min，脂多糖刺激人脐静脉内皮细胞，激光共聚焦显微镜检测细胞中钙离子浓度变化。

1.2.4 免疫共沉淀法分析Tlr4对人脐静脉内皮细胞中Stim1、髓质分化蛋白2、NF-κB蛋白表达的影响 人脐静脉内皮细胞接种于6孔板中常规培养12 h后，分为空白对照组、脂多糖组、Tlr4抑制表达载体+脂多糖组，转染12 h，脂多糖刺激6 h。RIPA提取细胞总蛋白50 μg，每组滴加1 μg Tlr4抗体，4 ℃孵育2 h，滴加Protein A/G琼脂糖30 μL过夜，预冷的细胞裂解液洗涤后，沉淀物行SDS-PAGE电泳，湿法转至PVDF膜，滴加鼠抗人Stim1单克隆抗体(1∶500)，鼠抗人髓质分化蛋白2、NF-κB单克隆抗体(1∶200)，鼠抗人GAPDH单克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃过夜，滴加HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶2 000)，室温静置2 h，ECL显色，暗室中显影、采集图像并分析各条带灰度值。

1.2.5 NF-κB对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞炎性介质及Stim1、NF-κB mRNA表达的影响 人脐静脉内皮细胞接种于6孔板中常规培养12 h后，分为空白对照组、脂多糖组、0.1 mg/L、1 mg/L PDTC组(脂多糖与PDTC共同刺激)、Tlr4抑制表达载体转染1 h、12 h组。酶联免疫吸附法检测细胞培养液上清中IL-6、TNF-α浓度。RIPA裂解液提取细胞总RNA，RT-PCR法检测Stim1、NF-κB mRNA表达水平。

1.3 统计学分析

数据使用SPSS23.0处理，以均数±标准差表示，进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脂多糖刺激不同时间Tlr4、髓质分化蛋白2、NF-κB mRNA表达

脂多糖刺激人脐静脉内皮细胞2 h、6 h、12 h时Tlr4、髓质分化蛋白2、NF-κB mRNA相对表达量明显高于刺激前(P<0.05)；脂多糖刺激6 h时Tlr4、髓质分化蛋白2、NF-κB mRNA相对表达量达到峰值。表1，图1，图2。

表1 脂多糖刺激不同时间Tlr4、髓质分化蛋白2、NF-ΚB mRNA表达

与刺激前比较，aP<0.05(n=6)

图1 脂多糖刺激不同时间Tlr4、髓质分化蛋白2、NF-κB mRNA表达变化

图2 脂多糖刺激不同时间Tlr4、髓质分化蛋白2、NF-κB mRNA表达的电泳图1：刺激前；2：刺激后1 h；3：刺激后2 h；4：刺激后6 h；5：刺激后12 h；6：刺激后24 h

2.2 Stim1对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞钙流动的影响

空白对照组、脂多糖组、Stim1抑制表达载体转染组、Stim1抑制表达载体+脂多糖组人脐静脉内皮细胞中钙离子浓度分别为(42.68±12.31)、(110.24±19.65)、(31.55±10.07)、(63.72±12.90) nmol/L。脂多糖组钙离子浓度明显高于空白对照组，Stim1抑制表达载体转染组钙离子浓度明显低于空白对照组，Stim1抑制表达载体+脂多糖组钙离子浓度明显低于脂多糖组(P<0.01)；Stim1抑制表达载体转染可显著逆转脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞外钙离子内流。见图3。

图3 Stim1对脂多糖诱导各组人脐静脉内皮细胞中钙离子浓度比较1：空白对照组；2：脂多糖组；3：Stim1抑制表达载体转染组；4：Stim1抑制表达载体+脂多糖组

2.3 Tlr4对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞钙流动的影响

空白对照组、脂多糖组、Tlr4抑制表达载体转染组、Tlr4抑制表达载体+脂多糖组、Tlr4及Stim1抑制表达载体+脂多糖组人脐静脉内皮细胞中钙离子浓度分别为(43.24±10.51)、(111.50±19.73)、(42.93±9.75)、(51.88±9.16)、(40.29±7.53) nmol/L。脂多糖组钙离子浓度明显高于空白对照组、Tlr4抑制表达载体转染组(P<0.01)；钙离子浓度在空白对照组与Tlr4抑制表达载体转染组之间差异无统计学意义(P>0.05)；Tlr4抑制表达载体+脂多糖组、Tlr4及Stim1抑制表达载体+脂多糖组钙离子浓度明显低于脂多糖组，其中Stim1抑制表达载体+脂多糖组下降最明显(P<0.05)。见图4。

2.4 脂多糖诱导Tlr4与髓质分化蛋白2蛋白结合

免疫共沉淀分析显示，空白对照组、脂多糖组、Tlr4抑制表达载体+脂多糖组抗Tlr4抗体沉淀物中髓质分化蛋白2蛋白相对表达量分别为(2.68±0.24)、(4.41±0.56)、(1.83±0.18)。脂多糖组髓质分化蛋白2蛋白相对表达量明显高于空白对照组，Tlr4抑制表达载体+脂多糖组髓质分化蛋白2蛋白相对表达量明显低于脂多糖组(P<0.05)。空白对照组、脂多糖组、Tlr4抑制表达载体+脂多糖组抗Tlr4抗体沉淀物中均未检测出Stim1、NF-κB蛋白表达。见图5，图6。

图4 Tlr4对脂多糖诱导各组人脐静脉内皮细胞中钙离子浓度1：空白对照组；2：脂多糖组；3：Tlr4抑制表达载体转染组；4：Tlr4抑制表达载体+脂多糖组；5：Tlr4及Stim1抑制表达载体+脂多糖组

图5 抗Tlr4抗体沉淀物中髓质分化蛋白2蛋白表达1：空白对照组；2：脂多糖组；3：Tlr4抑制表达载体+脂多糖组

图6 各组髓质分化蛋白2蛋白相对表达量比较1：空白对照组；2：脂多糖组；3：Tlr4抑制表达载体+脂多糖组

2.5 Tlr4、髓质分化蛋白2对细胞炎性因子及细胞钙信号的调节作用

脂多糖组IL-6、TNF-α浓度及Stim1、NF-κB mRNA表达水平均明显高于空白对照组(P<0.01)；与脂多糖组相比，0.1 mg/L PDTC组、1 mg/L PDTC组、Tlr4抑制表达载体转染12 h组IL-6水平明显降低(P<0.05)，而Tlr4抑制表达载体转染1 h组差异无统计学意义(P>0.05)；与脂多糖组相比，1 mg/L PDTC组TNF-α水平明显降低(P<0.01)，而0.1 mg/L PDTC组、Tlr4抑制表达载体转染1 h及12 h组差异无统计学意义(P>0.05)。1 mg/L PDTC组、Tlr4抑制表达载体转染12 h组Stim1、NF-κB mRNA表达水平明显低于脂多糖组(P<0.05)。见表2。

表2 Tlr4、髓质分化蛋白2对细胞炎性因子及细胞钙信号的调节作用

与空白对照组比较，aP<0.01；与脂多糖组比较，bP<0.05

3 讨 论

细菌内毒素通过与髓质分化蛋白2特异性结合后激活细胞内信号，Tlr4在此过程中具有重要作用[8-10]。相关研究显示，体外肝素预处理后，可拮抗脂多糖诱导的IL-6、粒细胞集落刺激因子水平上调，与激活Tlr4通路有关[11-12]。本研究显示，脂多糖可上调人脐静脉内皮细胞Tlr4表达，且髓质分化蛋白2表达水平也明显提升，具有明显的时间依赖性，在脂多糖刺激6 h时Tlr4、髓质分化蛋白2水平达到峰值。提示细菌内毒素通过活化细胞膜受体来发挥启动炎性介质的效应。同时脂多糖启动炎性介质分泌的转录因子NF-κB也具有明显的时间依赖性，且与Tlr4、髓质分化蛋白2变化趋势一致，提示细菌内毒素激活炎性介质生存的信号通路从活化受体Tlr4、髓质分化蛋白2到NF-κB大量分泌具有同步性特征，为抑制细菌内毒素炎性介质的产生提供了参考。

本研究显示，脂多糖刺激人脐静脉内皮细胞可引发钙离子内流增加，细胞内钙浓度异常升高；下调钙离子通道蛋白Stim1表达后可有效逆转脂多糖诱导的细胞外钙离子内流。提示Stim1可作为内毒素引发细胞内钙超载的作用靶点，特异性阻断细胞外钙离子内流。正常生理状态下Tlr4表达下调后对细胞外钙离子内流无明显影响，但能够有效逆转脂多糖诱发的细胞外钙离子内流。提示脂多糖诱发的钙超载与Tlr4明显相关，作用机制可能与Tlr4激活细胞内信号有关。同时转染Tlr4与Stim1后脂多糖诱发的细胞外钙离子内流进一步减少，提示Tlr4与Stim1可能共同介导了细菌内毒素引发的钙超载。免疫共沉淀检测显示，正常生理状态下血管内皮细胞中Tlr4与髓质分化蛋白2存在相互作用，在脂多糖刺激下该作用更明显，但能够被Tlr4表达下调所逆转。提示内毒素活化Tlr4的作用与髓质分化蛋白2明显相关，可能通过与髓质分化蛋白2形成复合物，活化细胞内信号，启动多个信号通路。但沉淀复合物中未检测出Stim1、NF-κB蛋白表达，提示内毒素Tlr4的活化未通过与Stim1、NF-κB之间的相互作用来实现，可能通过其他中间分子，仍需进一步深入研究。

Stim1可通过感受内质网中钙离子浓度变化，激活细胞膜上的钙池调控钙离子通道，引发细胞外钙离子内流[13-15]。本研究中在NF-κB抑制剂PDTC的干预下，能够有效逆转脂多糖上调Stim1、NF-κB表达的作用，提示Stim1表达与NF-κB明显相关。Tlr4抑制表达载体转染12 h可有效下调脂多糖诱导的Stim1、NF-κB表达，提示Stim1、NF-κB可能参与调控细菌内毒素上调Stim1表达发挥的生物学作用。NF-κB抑制剂PDTC还能够逆转脂多糖对细胞IL-6、TNF-α表达的影响，且具有明显的时间依赖性，提示细菌内毒素诱发炎性介质生成的过程中需转录活化因子NF-κB的参与，脂多糖可能通过作用于Tlr4、髓质分化蛋白2信号通路来活化NF-κB，进而启动钙池调控钙离子通道蛋白信号和炎性介质信号。