土壤支撑培养下的‘玫瑰香’葡萄组培快繁

王雪彤，柴慈江，郭静，朱霖，贺祥素

（天津农学院 园艺园林学院，天津 300384）

‘玫瑰香’是我国葡萄主栽品种，因其独特的风味和多重用途而深受消费者喜爱。天津滨海地区是‘玫瑰香’葡萄的主栽地区之一，以“茶淀牌”命名的‘玫瑰香’葡萄，以其优良的品质，在我国乃至国际市场上占有一席之地[1]。但是在‘玫瑰香’葡萄的长期栽培中，出现了严重的品种退化现象，这导致了大多数果品质量达不到标准，严重影响了果农的经济效益，所以‘玫瑰香’葡萄的提纯复壮是一项重要的任务[2]。而‘玫瑰香’优选单株快速推广的关键在于提高其苗木的繁育速度，其中组织培养快繁技术具有明显的优势。

目前，国内关于葡萄组织培养快速繁殖技术的研究已有许多报道，如齐向丽等研究了‘红国王’葡萄组培快繁体系的建立[3]，韩旭等对美国‘红地球’葡萄无毒苗快繁技术进行了研究[4]，徐美隆等对酿酒葡萄‘赤霞珠’组培快繁技术进行了优化[5]，蔡文博等报道了‘玫瑰香’等葡萄的组培快繁[6]。迄今为止，国内已经对至少50个不同葡萄的基因型进行了组培快繁技术的研究，其中包括不同的种、品种和品系。葡萄组培快繁技术也已经比较成熟。但是，成本过高历来是限制葡萄组培快繁技术应用于生产的主要因素之一。柴慈江等以土壤做培养基支撑物培养选拔巨峰葡萄试管苗，并将试管苗带坨移栽，简化了移栽程序并降低了试管苗的成本[7]。对‘玫瑰香’葡萄试管苗的土壤支撑培养目前未见报道，为此开展本项研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料取自‘玫瑰香’葡萄（Vitis vinifera‘Muscat Hamburg’）成年结果树，该葡萄树种植于天津农学院试验园内。生根培养用土取自本校地被植物园的黏壤土，经雨水淋洗、风干后过1 mm筛备用。生根培养所用蛭石购自花卉市场，同样过1 mm筛备用。

1.2 试验方法

1.2.1 ‘玫瑰香’葡萄茎段灭菌培养研究

不同次氯酸钠灭菌时间的研究：6月27日取‘玫瑰香’当年生新梢，去叶片后剪成单节茎段，用洗衣粉清洗和自来水冲洗后在 70%酒精中浸泡20 s，再在2%次氯酸钠中浸泡10、15、20 min，无菌水冲洗5次后接种于培养基中。每处理接种22个茎段。培养基为附加IBA 0.2 mg/L的GS培养基。在培养室培养1周后调查茎段的污染率、褐化率及萌芽率等指标。

不同取材时期的研究：9月27日再取玫瑰香当年生新梢，所取新梢已半木质化，颜色仍为绿色。去叶片并剪成单节茎段，洗衣粉清洗和自来水冲洗后，用70%酒精浸泡20 s，在2%次氯酸钠中浸泡10、15 min，无菌水冲洗5次后接种，每处理接种24个茎段。所用培养基、培养时间及调查指标均与6月27日取材的相同，并与之比较。

上述两项研究中培养室的培养条件为温度24～27℃，光照强度1 500～2 000 lx，每天光照14 h。

1.2.2 ‘玫瑰香’葡萄试管苗增殖培养研究

在GS培养基中分别添加0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L的IBA，并添加1 g/L的活性炭和7 g/L的琼脂，分装于100 mL的三角瓶中，121 ℃下灭菌20 min，每瓶接种4个‘玫瑰香’葡萄试管苗单节茎段，每个处理接种5瓶。在培养室培养，培养条件同试验1.2.1。培养30 d后调查试管苗的茎长、繁殖系数及生根率等指标。

1.2.3 ‘玫瑰香’葡萄试管苗土壤支撑生根培养研究

该项研究设以下3个处理：

土壤支撑培养Ⅰ：将黏壤土与蛭石按照1∶2的体积比混合，将100 mL混合物加入到方形PC培养瓶，再加入成分为15 g/L蔗糖和0.2 mg/L IBA的培养液60 mL，培养液pH为6.5，121℃下灭菌20 min，然后接种‘玫瑰香’葡萄试管苗单节茎段，每瓶接种8个茎段，接种4瓶。

土壤支撑培养Ⅱ：培养基配制及灭菌方法同土壤支撑培养Ⅰ，培养基灭菌后接种‘玫瑰香’葡萄试管苗双节茎段，接种茎段数量同土壤支撑培养Ⅰ。

琼脂支撑培养（对照）：在含有0.2 mg/L IBA的GS培养基中加入7 g/L琼脂做培养基支撑物，并添加1 g/L活性炭，121℃下灭菌20 min，灭菌后接种‘玫瑰香’葡萄试管苗单节茎段，每瓶接种4个茎段，接种8瓶。

以上各处理接种后均在培养室培养，培养条件同试验1.2.1。培养40 d后对试管苗的生根率、根长、根数、茎长、叶数等生根与生长指标进行调查。

1.2.4 ‘玫瑰香’葡萄试管苗移栽试验

以黏壤土与蛭石体积比为1∶1的混合物作为移栽基质，对2种不同移栽方法进行比较。

带坨移栽：采用土壤支撑培养Ⅱ方法的试管苗，先将营养钵内加入约1/2的移栽基质，使用提苗片将试管苗提起后，带坨移入营养钵中，移栽后用土将土坨四周填满，再浇透水至营养钵底部有水流出。

常规移栽：采用琼脂支撑生根培养的试管苗，先将根上琼脂洗净，然后将试管苗裸根移入营养钵中。然后填土并浇透水。

移栽后用塑料薄膜保湿，放在向阳的房间内，移栽3周后调查试管苗成活率。

上述各项试验，对调查的生根率、成活率等百分数指标均按照卡平方法进行独立性测验，对其他各项指标均按照完全随机试验单向分组资料的方法进行方差分析，用邓肯氏新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 消毒时间与‘玫瑰香’茎段的灭菌效果

不同次氯酸钠浸泡时间对‘玫瑰香’茎段灭菌培养的效果如表1所示。

表1 次氯酸钠浸泡时间对‘玫瑰香’茎段的灭菌效果

从表1可见，从污染率来看，次氯酸钠浸泡10、15、20 min 3个处理之间无显著差异，污染率在20%左右，灭菌效果较好。但是3个浸泡时间处理的茎段都出现不同程度的褐化现象，其中浸泡20 min处理的褐化率高达81.8%，显著高于10、15 min处理，10、15 min处理之间的褐化率差异不显著。与褐化率相反，10、15 min处理萌芽率较高，且这两个处理之间差异不显著，但均显著高于20 min处理。上述结果表明，用2%次氯酸钠浸泡10、15 min可以获得较好的灭菌效果，且褐化率较低、萌芽率较高，而浸泡20 min时对葡萄茎段伤害较大，导致萌芽率显著降低。因此，对于6月下旬采集的‘玫瑰香’葡萄当年生新梢茎段，用2%次氯酸钠浸泡10～15 min为宜。

次氯酸钠浸泡不同时间后‘玫瑰香’葡萄茎段的生长状况见图1。

图1 次氯酸钠浸泡时间对‘玫瑰香’茎段灭菌培养的影响

2.2 取材和时间与‘玫瑰香’茎段的灭菌效果

表2为不同取材时间对‘玫瑰香’茎段灭菌培养的效果。

由表2可见，无论是次氯酸钠浸泡10 min，还是浸泡15 min，9月取材的茎段的污染率均显著高于6月取材的，而且污染率高达91.6～95.8%，其原因可能是茎段的带菌量过高的缘故。此外，9月取材的茎段无褐化现象，显著低于6月取材的茎段，可能与 9月的茎段比较成熟有关，但是 9月取材的茎段萌芽率为0，显著低于6月，可能与9月的芽已将进入休眠期有关。

表2 不同取材时间对‘玫瑰香’茎段灭菌培养的影响

综合上述，9月27日取材的茎段，污染率过高且不能萌芽，因此，不适合用于组培快繁。而应在6月取材。

2.3 不同浓度IBA对‘玫瑰香’葡萄试管苗的增殖和生长的影响

表3为不同浓度IBA对‘玫瑰香’葡萄试管苗增殖培养的效果。

表3 IBA浓度对‘玫瑰香’葡萄试管苗增殖的影响

由表3可见，不同IBA浓度处理的‘玫瑰香’葡萄试管苗的生根率、茎长和繁殖系数等各项指标均无显著差异。这一结果表明，添加IBA对‘玫瑰香’葡萄试管苗的增殖没有明显的促进作用。在不含IBA的培养基中，试管苗的生根率仍然可以达到 90%，这可能与‘玫瑰香’葡萄枝条容易生根有关。在不含IBA的培养基中，试管苗的繁殖系数达到3.6，可以满足快速繁殖的要求。因此，为了降低成本，在‘玫瑰香’试管苗增殖培养中，培养基中可不添加激素。

图2为不同IBA处理的‘玫瑰香’葡萄试管苗生长状况。

图2 不同IBA浓度对‘玫瑰香’葡萄试管苗增殖培养的影响

2.4 土壤支撑物培养下的‘玫瑰香’葡萄试管苗的生长特性

表4为‘玫瑰香’葡萄试管苗生根培养试验结果。

表4 ‘玫瑰香’葡萄试管苗土壤支撑生根培养效果

由表4可见，土壤支撑生根培养中，接种单节茎段时的生根率、根长、茎长、叶数等各项指标都显著低于琼脂培养基中的试管苗。表明土壤支撑物对‘玫瑰香’葡萄试管苗的生根及生长具有明显的抑制作用。但是，土壤支撑培养接种双节茎段时，生根率达到84.4%，根长为31.9 mm，这些指标都与琼脂培养基无显著差异，都显著高于单节茎段处理，这说明在土壤支撑培养条件下，接种双节茎段明显促进了根系的发生与生长，并且达到了琼脂培养基中试管苗生长的水平，但是接种双节茎段试管苗的茎长和叶数仍然显著低于琼脂培养基，表明土壤对地上部的生长仍然有明显的抑制作用。

通过对根系表面的观察发现，两个土壤支撑处理的试管苗的根系都具有根毛，而琼脂支撑培养的试管苗无根毛，由于根毛可以明显增加根系的吸收面积，增强根系的吸收能力，从这个角度看，土壤支撑培养的试管苗的根系结构优于琼脂支撑培养。

综合上述，土壤做培养基接种双节茎段处理，虽然茎和叶片的生长还达不到琼脂培养基培养的水平，但是生根率、根长及根数等指标已经达到了琼脂培养基培养的水平，而且根系具有根毛，根系结构优于对照。所以，在‘玫瑰香’葡萄试管苗的生根培养中，在接种双节茎段的情况下，可以用土壤替代琼脂做培养基支撑物，即可以获得理想的培养效果，又可以节省成本。图3为不同支撑物处理的‘玫瑰香’葡萄试管苗生根状况。图4为‘玫瑰香’葡萄试管苗根毛发生状况。

图3 ‘玫瑰香’葡萄土壤支撑生根培养效果

图4 ‘玫瑰香’葡萄试管苗根毛发生状况

2.5 ‘玫瑰香’葡萄试管苗带坨移栽的效果

表5为‘玫瑰香’葡萄试管苗移栽试验结果。

表5 移栽方法对‘玫瑰香’葡萄试管苗成活的影响

由表5可见，试管苗带土坨移栽的成活率为75%，常规移栽试管苗的成活率为25%，2种移栽方法之间的成活率存在显著差异。其原因可能与带坨移栽后试管苗根际环境变化较小，根系吸收能力较强有关，也可能与土壤支撑培养的试管苗具有根毛，吸收面积较大有关。对此尚待进一步研究。

图5为从培养瓶移出的带土坨‘玫瑰香’葡萄试管苗。图6为移栽成活的‘玫瑰香’葡萄试管苗。

图5 从培养瓶移出的带土坨‘玫瑰香’葡萄试管苗

图6 移栽成活的‘玫瑰香’葡萄试管苗生长状况

3 讨论与结论

木本植物试管苗的增殖方式常见的有两种，即促进腋芽分枝形成丛生枝和单节扦插形成单轴延长的茎。对于葡萄试管苗的增殖方式，一些研究中采用了形成丛生芽的方式[8-9]，另一些研究则采用了单节扦插单轴延长的方式[3-4，10-11]。在同一种增殖方式中，针对不同的葡萄种类、品种或品系所得出的最佳培养基和最佳激素种类和浓度不尽相同。例如，同样采用单节扦插单轴延长增殖方式，齐向丽等研究认为在 B5培养基中添加 0.5 mg/L IAA最适合‘红国王’葡萄试管苗的增殖[3]，戴彩虹等研究认为附加0.1 mg/L NAA的GS培养基最适合山葡萄试管苗的增殖[11]，沈传进等研究认为附加0.2 mg/L IBA的改良B5培养基对无核白和早熟红无核葡萄试管苗的增殖最为有利[10]。造成这种不一致的原因，可能是不同的葡萄基因型之间在生理及生长方面存在的差异所致。本项研究中，‘玫瑰香’葡萄试管苗可在不含任何激素的GS培养基中达到90%的生根率和3.6的繁殖系数，可能与‘玫瑰香’葡萄枝条容易生根有关。

培养基中琼脂的使用是导致试管苗成本增高的原因之一。葡萄试管苗的生根培养通常是在琼脂培养基中进行的，这种生根方法不仅会增加成本，而且会造成试管苗移栽困难。柴慈江等以沙壤土或蛭石替代琼脂进行葡萄试管苗生根培养，试管苗生根率达到 90%以上，对试管苗带坨移栽可以获得80%或90%以上的成活率[7，12]。但是在这两项研究中，均在培养基中添加了GS培养基配方中的常量元素、微量元素及维生素等简单有机物等成分。柴慈江等对栒子和无核枣试管苗的研究结果表明，以土壤做培养基支撑物时，不添加无机盐和简单有机物反而会促进试管苗的生长[13-14]。在对珠美海棠、矮溲疏等试管苗的土壤支撑培养中也都取得了类似的结果[15-16]。本项研究中，对‘玫瑰香’葡萄试管苗采用黏壤土与蛭石的混合物做培养基支撑物，培养基中只添加IBA和蔗糖，不添加无机盐和维生素等简单有机物，取得了较为理想的培养效果。与柴慈江等对选拔巨峰葡萄试管苗的研究结果相比[7]，由于培养基中省去了无机盐和简单有机物，因此，进一步降低了试管苗的成本。

综上所述：6月27日取‘玫瑰香’葡萄当年生新梢茎段，用2%次氯酸钠浸泡10～15 min可以获得较好的灭菌培养效果，9月下旬的枝条不适合用于组培快繁；‘玫瑰香’葡萄试管苗的增殖培养以使用不含激素的GS培养基为宜；以黏壤土与蛭石的混合物做培养基支撑物，接种双节茎段，可使‘玫瑰香’葡萄试管苗的生根率达到84.4%，与琼脂培养基对照无显著差异，根系结构优于对照；土壤支撑培养的‘玫瑰香’葡萄试管苗带坨移栽的成活率为 75%，显著高于琼脂支撑培养常规移栽的试管苗。