深圳填海区植物根际土壤耐盐菌株筛选与鉴定

2020-04-11宋郭柳王梦华郑利锦袁峰均史正军

广东农业科学 2020年1期

宋郭柳，王梦华，郑利锦，袁峰均，史正军

（1.深圳市万卉园景观工程有限公司，广东深圳 518042；2.广州诺晶生物技术有限公司，广东广州 510000；3.深圳市中国科学院仙湖植物园，广东深圳 518004）

【研究意义】世界一半以上的人口、生产和消费活动集中在占全球面积不到10%的海岸带地区［1］，人们对沿海地区土地的需求不断增大，填海造地成为人们解决“土地赤字”的主要方式［2-3］。然而，由于海岸带土壤常年受海水侵蚀，其盐分含量较多，以氯化钠为主［4］。填海造地意味着海岸带生态系统自然属性的永久改变，海水加上周边高盐水汽的浸润使得填海区土壤更易呈现高盐碱状态［5］。土壤中过量的盐分离子对植物生长有抑制作用，一些离子还可对植物产生直接毒害，使植物形态和结构发生变化，细胞膜破坏，营养失衡［6-7］。因此，改造和治理填海区盐碱土地对改善生态环境，推动区域社会、经济和生态的可持续发展具有十分重要的意义，而研究耐盐菌株的分布特征可为下一步盐渍土改良和降低植物盐害工作提供有益参考。【前人研究进展】盐碱地生物改良具有重要的现实意义，其措施主要包括种植耐盐植物或作物、使用微生物菌肥等方法［8］。刘延吉等［9］从辽宁省宁口沿海产业基地的植物根际盐碱土中筛选出82株耐盐细菌，均可在6%盐浓度的TSB培养基中生长，且对草籽生长有一定的促进作用。周红姿等［10］从盐碱地土壤中分离筛选出12株耐盐细菌，经鉴定分别为假单胞菌属（Pseudomonas），黄杆菌属（Flavobacterium），盐单胞菌属（Halomonas），微球菌属（Micrococcus）和芽孢杆菌（Bacillus），各菌株的耐盐极限为10%，且对小麦、番茄、辣椒和黄瓜没有潜在致病性。此外，徐珂等［11］从新疆盐碱地土壤中分离得到11株耐盐能力较高的菌株，均为产芽胞，革兰氏阳性细菌。PCR扩增结果表明，只有5株细菌含有pro耐盐基因，暗示这些耐盐细菌具有不同的耐盐机制。【本研究切入点】耐盐菌在盐渍土壤中分布广泛，研究其分布特征可为填海区高盐土壤的生物修复和治理提供菌种资源。【拟解决关键问题】本研究拟从深圳坝光和宝安填海区灌木根际采集土壤样品，利用不同浓度的NaCl培养基分离耐盐菌种，并通过电镜形态观察和基因组DNA扩增测序对其进行鉴定，以期为下一步填海区盐渍土改良和降低植物盐害工作提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

LB培养基（环凯，中国，含1%NaCl）、高盐LB培养基（在LB培养基中补充添加不同浓度的NaCl）、灭菌盐水（1% NaCl）、ECO生化鉴定板及缓冲液（Biolog，美国）。

土壤样品采集：于2019年7月从深圳东部的坝光填海区和深圳西部的宝安填海区多年生灌木根际采集土壤样品。采用抖落法随机选取5处灌木采集根际土壤样品，共10个土样。采样时，用干净小铲以植株为中心，挖取深约20 cm、长20 cm的带植株根系的完整土块，放置在塑料布上，小心敲去根系周围浮土，抽出根系后再抖动，保留由根系上洒落的土壤，放入无菌密封袋中，每个土样为5～8株植物根际土壤的混合样。样品采集后迅速带回实验室，过1 mm尼龙网筛，4℃条件下保存备用。经测定，各采样点土壤含盐量分布在4～10 g/kg，土壤pH分布在8.1～9.3。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤悬液的制备称取3 g土壤样品于50 mL灭菌离心管中，添加灭菌盐水30 mL，置于恒温摇床上30 ℃振荡1 h（200 r/min），使土样均匀分散在灭菌盐水中成为土壤悬液。

1.2.2 菌株的初级分离向1.5 mL离心管中依次加入900 μL灭菌盐水和100 μL土壤悬液，按10倍梯度依次稀释，再取100 μL稀释液涂布于LB平板，30 ℃过夜培养。

1.2.3 菌株分离纯化及耐盐性分析将上述LB平板上生长的菌落进行4次划线纯化，对得到的纯化菌株进行耐盐能力分析。将上述菌株分别接种于不同NaCl浓度（5%、5%、10%、15%、20%、25%、30%）的培养基中。根据初试结果，将具有耐盐能力的菌株进行耐盐极限分析，将其接种在盐含量12%、14%、16%、18%、22%、24%的LB培养基上，30 ℃下培养72 h，观察其生长情况。

1.2.4 菌株细胞电镜形态观察按照常规透射电镜负染色制样方法进行制样，制样及观察过程中的问题处理方式参照刘湘花等［9］的研究；采用FEI-Tecnai 12透射电子显微镜（菲利浦，荷兰）进行观察并拍照。

1.2.5 耐盐菌株分子鉴定使用细菌基因组DNA提取试剂盒（TaKaRa，中国）提取耐盐菌株DNA。细菌16S rDNA基因扩增引物27F/1492R序列以及扩增程序参照Chen等［11］的研究。PCR扩增产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果与 GenBank相关数据进行同源性分析，确定耐盐菌株的分类地位。

1.2.6 菌株碳源利用分析利用美国BIOLOG公司生产的ECO碳源平板（GENⅢMICROPLATE），对3株不同耐盐度的代表菌株进行碳源利用情况分析，通过肉眼观察及分光光度检测确定各菌株碳源利用情况。

2 结果与分析

2.1 耐盐菌的分离纯化及耐盐能力分析

从LB培养基平板分离出66株植物根际菌株，在5% NaCl中生长的菌株有55株，在10% NaCl中生长的有14株，编号分别为NY1～NY14。其中，12株能在12% NaCl培养基中生长，11株能在14% NaCl培养基中生长，但当NaCl浓度达到16%及以上时，细菌均不能生长（表1）。

2.2 耐盐菌株的分子鉴定

利用细菌鉴定通用引物27F和1492R对14株细菌的基因组DNA进行扩增并测序，结果（表2）表明，14株耐盐菌中有13株来自芽孢杆菌属，占总耐盐菌的93%，仅有1株来自溶杆菌属。13株芽孢杆菌中3株可以鉴定到种水平，另外10株仅能鉴定到属水平。

2.3 耐盐菌的电镜形态特征

对筛选出的耐盐菌进行电镜观察，发现14株耐盐菌具有不同的形态，其中13株细菌来自芽孢杆菌属，但是形态差异较明显。NY1、NY2、NY6、NY7、NY9和NY11呈长条状，NY3、NY4、NY5、NY8、NY10、NY12、NY13呈现出椭圆状，且NY3、NY5、NY10、NY13观察到明显的鞭毛。电镜形态扫描和分子鉴定结果表明，盐渍根际土壤中耐盐菌具有较高的丰富度和多样性（图1）。

2.4 代表菌株碳源利用特征

随机挑选出NY1、NY2、NY12等3株菌进行ECO碳源利用分析，结果发现，3株菌均能利用的碳源有16种，包括水苏糖、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-组胺、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖醛酸内酯、D-葡糖酸、葡糖醛酰胺、羟基-苯乙酸、酮酸甲酯、柠檬酸、α-酮-戊二酸、溴-丁二酸、γ-氨基 -丁酸、乙酰乙酸。此外，NY1可以利用6种其他碳源：糊精、D-海藻糖、α-D-乳糖、D-葡糖醛酸、D-乳酸甲酯、吐温40，总计可以利用22种碳源，占ECO总碳源种类的31%；NY2可以利用13种其他碳源：D-海藻糖、D-松二糖、蜜二糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-果糖、D-天冬氨酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、粘液酸、奎宁酸、D-乳酸甲酯、D-苹果酸，总计可以利用29种碳源，占ECO总碳源种类的41%；NY12可以利用16种其他碳源：D-纤维二糖、α-D-乳糖、蜜二糖、D-半乳糖、D-果糖、D-葡糖-6-磷酸、D-天冬氨酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-精氨酸、粘液酸、奎宁酸、D-苹果酸、α-羟基-丁酸、β-羟基-D,L -丁酸、α-酮-丁酸、丙酸，总计可以利用32种碳源，占ECO总碳源种类的45%。因此，NY12菌株具有更强的碳源利用能力。

表1 耐盐菌的NaCl浓度耐受极限Table 1 Tolerance limits of NaCl concentrations of salt-tolerant bacteria

表2 耐盐菌株鉴定结果Table 2 Identification of salt-tolerant strains

图1 TEM下耐盐菌形态Fig.1 Salt-tolerant strains morphology by TEM

3 讨论

盐生植物的根际和根内分布着大量的嗜盐菌，它们在盐胁迫下的盐生植物生长中起着重要作用［12］。本研究从深圳填海区灌木根际土壤中分离出高耐盐细菌14株，耐盐度均达到10%以上，多数株能达到14%，这与张广志等［10］报道的从盐碱土中分离的芽孢杆菌耐盐范围（10%～15%）一致。在分离得到的14株耐盐菌中，有13株属于芽孢杆菌，这与多数研究一致［13-14］，表明填海区植物根际土壤具有丰富的芽胞杆菌菌群多样性。

碳源是微生物生长的必须要素，Biolog ECO板根据微生物对碳源的利用能力差异，用来研究群落中微生物的动态变化［15］。本研究利用Biolog ECO碳源板探究了3株耐盐菌碳源利用情况，结果发现3株细菌均能利用多种碳源，表明这些菌株可能具有较强的环境适应能力。植物根际微生物能产生植物生长激素、细胞分裂素、乙烯、维生素以及其他植物生长物质，在促进植物生长和改善土壤质量方面起着关键作用［16-17］。植物促生菌已被广泛报道，可以促进植物根系生长、营养元素吸收和光合作用等［18］。常见的根际促生菌包括伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、固氮菌属（Azotobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）、节杆菌属（Arthrobacter）、固氮螺菌属（Azospirillum）、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、黄杆菌属（Flavobacterium）等［19］。Turan 等［20］研究发现，在温室条件下巨大芽孢杆菌TV-91C、枯草芽孢杆菌TV-17C对甘蓝幼苗的生长具有明显的促进作用，且可以改善其营养成分和激素，这表明芽孢杆菌在植物促生和经济性状改良等方面具有开发利用价值。在本研究中，从填海区植物根际土壤共分离得到13株高耐盐的芽孢杆菌，一方面，芽孢杆菌通过直接合成生长激素等化合物供植物利用；另一方面，通过对病原微生物的生物防治（拮抗作用、信号干扰等），抑制有害根际微生物，从而间接促进植物生长［21］。因此，在今后的研究中，可进一步探索高耐盐的芽孢杆菌在盐碱地作物生产上的应用及其潜在机制。