异常血红蛋白Hb J-Bangkok的分子诊断及血液学特征分析*

胡听听，郭浩，秦丹卿，杜丽，尹爱华

(广州医科大学附属省妇儿医院医学遗传中心妇幼代谢与遗传病重点实验室，广州 511440)

血红蛋白病包括异常血红蛋白病和地中海贫血。异常血红蛋白病是一种血液中结构异常的血红蛋白部分或全部取代正常血红蛋白，引起血液系统或其他系统异常的疾病[1]。研究证实，大多数结构异常的血红蛋白是由于血红蛋白相关基因发生突变(如插入、缺失、替换、移码突变等)[2]。目前发现的异常血红蛋白有多种(http://globin.bx.psu.edu/)，但只有极少部分可引起临床症状。地中海贫血是由于血红蛋白基因点突变或缺失引起血红蛋白合成相对不足，是一种遗传性溶血性贫血[3]。有学者证实，如果异常血红蛋白合并地中海贫血，有可能使患者的临床症状加重[4]，并且无症状的血红蛋白病可能随着年龄增长而导致症状加重[5]。我国南方地区地中海贫血发病率高、影响大，广东和广西地区尤其高发[6]，有必要对每一种异常血红蛋白进行仔细研究，阐明其分子机制和临床表现。地中海贫血相关研究和报道较多，而异常血红蛋白病报道相对较少，故本研究拟对2015年至2019年我院发现的9例携带有异常血红蛋白Hb J-Bangkok的患者进行临床血液学和分子诊断学研究。报道如下。

1 病历资料与方法

1.1病历资料 收集2015年1月至2019年12月于我院门诊及住院就诊的血液病患者9例，男4例，女性5例，年龄21～45岁，中位年龄32.67岁，均行血红蛋白电泳筛查呈异常血红蛋白J带，且经基因测序确诊其携带有β珠蛋白基因c.170 G>A 杂合突变(codon 56 GGC>GAC)。患者均自诉没有经历过输血治疗或者骨髓移植。本研究通过广州医科大学附属省妇儿医院医学伦理委员会审核批准，编号：广东省妇幼保健院医伦第[202001008]号，所有研究对象均知情同意。

1.2主要仪器与试剂 XS-1000i全自动血细胞分析仪及配套检测试剂盒(日本Sysmex公司)；Capillar 2全自动毛细管电泳仪及配套检测试剂盒(法国Sebia公司)；地中海贫血(α/β)基因检测试剂盒(PCR-流式荧光杂交法，中山大学达安基因公司)；Luminex MagPix多功能液相悬浮芯片系统(美国Luminex Corporation公司)；MN外周血全基因组柱提法试剂盒(MN Genomic DNA from blood，德国Macherey-Nagel GmbH &Co.KG公司)；NanodropND-1000紫外分光光度计(美国Thermo Scientific公司)；ABI 3500XL一代测序仪(美国Applied Biosystems公司)

1.3标本采集 采集各患者就诊时的外周静脉血(无需空腹)4～5 mL，EDTA-K2抗凝,分为两管，一管进行外周血血常规及血红蛋白电泳检测，另一管进行基因检测。采集后的标本室温保存并立即送检。

1.4血细胞参数分析 取各患者EDTA-K2抗凝外周血标本2 mL，采用XS-1000i全自动细胞分析仪及配套检测试剂盒检测患者血细胞参数，包括Hb(男：130～175 g/L，女：115～150 g/L)、MCV(参考范围：82～100 fL)、MCH(参考范围：27～34 pg)等，采用Sebia Capillar2全自动毛细管电泳仪及配套检测试剂盒分析患者血液血红蛋白组分，包括HbA(参考范围：94.50%～97.35%)、HbA2(参考范围：2.7%～3.5%)、HbF(参考范围：0%～2.50%)、HbJ(参考范围：0%)等。以上实验均按照仪器和试剂说明书操作。

1.5外周血DNA提取 取各患者2～3 mL外周血，按照MN外周血全基因组柱提法试剂盒说明书操作提取外周血DNA。使用NanodropND-1000紫外分光光度计进行DNA浓度和纯度测定。取浓度为20～100 ng/μL，吸光度(A260/280 nm)为1.8～2.2的样本用于后续试验，样本置于-20 ℃保存。

1.6常规地中海贫血基因检测 按照地中海贫血(α/β)基因检测试剂盒(PCR-流式荧光杂交法)及Luminex MagPix多功能液相悬浮芯片系统说明书操作对包括α-珠蛋白基因3种缺失(--SEA、-α3.7和-α4.2)、3种突变(WS122、QS125和CS142)，β-珠蛋白基因17种突变(包括CD41-42、IVS-Ⅱ-654、CD17、-28、CD26、CD71-72、CD43、-29、Int、CD14-15、CD27-28、-32、-30、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、CD31和Cap)进行检测，结果判读参照试剂盒说明书及参考文献[7]进行。

1.7α/β-珠蛋白基因测序 根据GenBank中β-珠蛋白基因(HBB)的序列号(NG_000007.3)，使用Primer Premier 6.0软件设计3对引物扩增β-珠蛋白基因3个外显子(引物序列见表1)，引物由英潍捷基(上海)公司合成；PCR扩增体系为50 μL，包括TaKaRa LA Taq体系：LA Taq酶0.5 μL，10×LA Taq Buffer Ⅱ(Mg2+Plus)5 μL，dNTP Mixture 8 μL，引物各1 μL，基因组DNA 50 ng，灭菌水28 μL。PCR循环参数：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35个循环；72 ℃延伸7 min。取PCR产物送往英潍捷基(上海)贸易公司进行基因测序，所用仪器为ABI 3500XL一代测序仪，采用Sequence Scanner软件将所测序列片段[NG_000007.3 REGION:complement(5225344..5227106)]与HBB标准序列进行比对。

表1 β-珠蛋白基因测序引物序列

2 结果

2.1毛细管电泳和血常规检测结果 9例患者均检出β珠蛋白基因c.170 G>A突变(codon 56 GGC>GAC)，为异常血红蛋白Hb J-Bangkok，其红细胞参数Hb、MCV和MCH正常或轻度异常；结果见图1和表2。

注：A，患者1的血红蛋白电泳结果(杂合Hb J-Bangkok)；B，患者9的血红蛋白电泳结果(纯合Hb J-Bangkok)；横坐标，各组分血红蛋白电泳时间；纵坐标，血红蛋白相对含量。

图1 血红蛋白毛细管电泳结果

表2 9例异常血红蛋白Hb J-Bangkok 血细胞参数和血红蛋白电泳结果

注：RDW，红细胞分布宽度；HETE，杂合子(heterozygote)；HOMO，纯合子(homozygote)。

2.2常规地中海贫血基因检测结果 9 例患者的DNA经过液相芯片检测，其中8例常规地中海贫血基因检测结果均为阴性，另1例男性患者的基因型为αQSα/αα，为Hb J-Bangkok合并α-地中海贫血。

2.3α/β-珠蛋白基因测序结果 9例样本测序结果显示β珠蛋白基因c.170 G>A 突变(codon 56 GGC>GAC)，其中1例女性为c.170 G>A 纯合突变(homo codon 56 GGC>GAC)，为异常血红蛋白Hb J-Bangkok。测序结果见图2。

注：A，患者9异常血红蛋白Hb J-Bangkok(箭头所示为HBB:c.170 G>A,codon 56 GGC>GAC,HOMO)；B，患者1异常血红蛋白Hb J-Bangkok(箭头所示为HBB:c.170 G>A,codon 56 GGC>GAC,HETE)。

图2 异常血红蛋白J-Bangkok测序结果

3 讨论

临床上常用反相高效液相色谱(RP-HPLC)和赛比亚毛细管电泳(Sebia capillary)方法分析并发现特异性的异常血红蛋白，根据电泳时异常带出现的位置对异常血红蛋白进行分组[8-9]。Hb J-Bangkok在血红蛋白电泳时见于J组，是一种快速的异常血红蛋白。由于同一电泳区带内可包含多种血红蛋白，单纯的电泳不能区分其具体的类型，仍需要通过珠蛋白基因序列分析来鉴定。地中海贫血是一组遗传性溶血性贫血疾病，轻症患者一般无明显临床症状，中度或重度患者需要终身输血治疗或者胎死宫内。由于异常血红蛋白与地中海贫血临床表现相似，通过常规血液学分析难以区分，故需要使用基因序列分析[10]。有报道显示异常血红蛋白合并地中海贫血时可加重患者的临床症状[4,11]，也有报道认为异常血红蛋白合并地中海贫血表现为单纯的地中海贫血症状[12]，故而多种因素引起的临床贫血症状需要综合分析。

目前,在我国所发现的异常血红蛋白中，最为常见的是血红蛋白分子外部氨基酸发生替代，Hb J-Bangkok即为其中一种。它是由于β血红蛋白基因点突变导致所编码的血红蛋白β链56位氨基酸发生改变，由天门冬氨酸取代了正常的甘氨酸。这种改变并不影响血红蛋白分子的功能和稳定，且携带氧气的能力也未降低，因而推测单纯的Hb J-Bangkok没有贫血等血液学的改变。本研究检测的7例单纯的Hb J-Bangkok携带者中，5例血液学参数均正常，无贫血等临床表现，这与上述推测的结论相同[4]，也与先前文献报道的结果相似[13]。与以上5例携带者不同的是其他2例女性携带者有轻度贫血的症状，其中病例1提示为明显降低的血清铁蛋白(FER：3.42 ng/mL)，诊断为缺铁性贫血[14]。另一病例为有双胎的孕妇，考虑有生理性贫血的可能。本研究发现1例HBB:c.170 G>A 纯合突变的病例，血红蛋白电泳显示高达97.3%的Hb J，而无成人正常的血红蛋白HbA。患者只有轻度降低的血红蛋白量,其他相关血液学指标均正常，表明纯合的Hb J Bangkok的患者也仅有轻度贫血的临床表现。此例纯合的Hb J-Bangkok病例为国内首次报道。此外还有1例男性患者为轻度α地贫(αQSα/αα)合并Hb J-Bangkok，其相关血液学指标与轻度α地贫相似，显示合并Hb J-Bangkok时并不显著影响轻度α地贫患者的血液学表现。

综上所述，本研究对异常血红蛋白Hb J Bangkok血液学特征的分析，有助于增强和提高我们对常见异常血红蛋白的认识和重视，对遗传咨询和产前诊断也可以具有参考价值。然而，本研究中缺少Hb J-Bangkok合并β地贫的病例的总结和分析，相关病例的报道和文献也较少，故而无法对Hb J-Bangkok对地贫的影响做一个全面的分析。今后我们将继续收集病例，完善资料，进行更深入的相关研究。