一次食源性致病菌质控样的检验结果分析

谭建兵，周亮

（1.重庆市开州区妇幼保健院，重庆 405400；2.重庆市开县疾病预防控制中心，重庆 405400）

1 实验

1.1 材料 （1）考核样品编号：CQ-ZK15，无菌管装，每管装3 g×2支。（2）培养基。肠道增菌肉汤、缓冲蛋白胨水（BPW）、GN增菌肉汤、EC肉汤、7.5%Nacl肉汤、李氏增菌肉汤、胰酪胨大豆多粘菌素肉汤、伊红美蓝（EMB）、山梨醇麦康凯（SorbitolMacConKey），血平板，李斯特氏菌科玛嘉琼脂、甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂、阪崎杆菌显色培养基（DFI）、肠杆菌科细菌生化编码鉴定系统E75/15，以上培养基均为北京陆桥试剂有限公司生产。API20E细菌生化编码鉴定系统由法国梅里埃公司生产[1]。（3）诊断学清：致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌、产毒性大肠埃希氏菌诊断血清、出血性大肠埃希氏菌O157血清、沙门菌A-F多价O血清均为宁波天润生物药业有限公司生产，均在有效期内。

1.2 样品处理 用40-50oC灭菌过的生理盐水将奶粉充分溶解。

1.3 增茵培养 移取1 mL分别加入10 mL肠道增菌肉汤、缓冲蛋白胨水（BPW）、GN增菌肉汤、EC肉汤、7.5%Nacl肉汤、李氏增菌肉汤、胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中，李氏增菌肉汤和胰酪胨大豆多粘菌素肉汤于30oC培养24 h，其余增菌液于36oC培养18-24 h。

1.4 分离培养 无菌操作取增菌液一环分别划线接种相对的伊红美蓝（EMB）、木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐培养基（XLD）、山梨醇麦康凯，血平板，李斯特氏菌科玛嘉琼脂、甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂、阪崎杆菌显色（DFI）平板各1块。MYP琼脂平板于30oC培养24 h，其余平板于36oC培养24 h。观察所有培养基平板上的菌落形态、色泽等特点。发现李斯特氏菌科玛嘉琼脂平板、甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）平板、阪崎杆菌显色（DFI）平板、山梨醇麦康凯平板、木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐（XLD）平板、伊红美蓝（EMB）平板上有可疑菌落，并将其涂片染色。

1.5 生化和血清学鉴定 （1）将李斯特氏菌科玛嘉显色培养基上的可疑菌落接种木糖、鼠李糖，36oC培养24 h，同时于TSA-YE平板上纯化30oC培养48 h，挑取纯培养的单个菌落接种SIM培养基30oC培养48 h并同时做生化鉴定，结果观察如下：动力见伞状生长，过氧化氢酶+，MR/VP+/-,溶血反应+，鼠李糖+，木糖-，甘露醇-，葡萄糖+，麦芽糖+，生化结果完全符合单增李斯特氏菌的生化特性。（2）将甘露醇卵黄多粘菌素培养基上的可疑菌落接种于营养琼脂平板上纯化，营养琼脂平板上可见粗糙、毛玻璃状的边缘向外扩展菌落，挑取典型菌落做生化鉴定，结果如下：过氧化氢酶+、西蒙氏枸橼酸盐+、动力+、硝酸盐+、VP+、木糖-、明胶+、甘露醇-、葡萄糖+，生化结果完全符合蜡样芽胞杆菌的生化特性。（3）挑取山梨醇麦康凯培养基、木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐培养基、伊红美蓝培养基上的可疑菌落转种于TSI上，36oC培养24 h后，三种培养基上的可疑菌落在TSI上生化表现相同，上层下层均变黄并产生大量气体，挑取TSI斜面上的菌落进行纯化培养后与致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌、产毒性大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验，结果都未发生凝集，生理盐水对照不凝集。将木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐培养基上的可疑菌落进行纯培养后与沙门氏菌多价O血清做玻片凝集试验，结果为强凝集，生理盐水对照不凝集。在进行血清凝集试验的同时用北京陆桥有限责任公司生产的E75/15肠杆菌科细菌鉴定系统鉴定三种培养基上可疑菌落的纯化菌落，生化鉴定结果均相同，鉴定编码均为54265，查检索表结果为：阪崎肠杆菌概率为97.36%，见表1。

取分纯后的菌落同时采用API20E细菌生化编码鉴定系统做生化鉴定，鉴定编码均为3305373，查检索结果为阪崎肠杆菌概率为98.40%，见表2。

2 结果

根据菌落特征、菌体形态、生化反应结果和血清凝集试验，最终判定李斯特氏菌科玛嘉显色培养基上的可疑菌落为单增李斯特氏菌。甘露醇卵黄多粘菌素培养基上的可疑菌落为蜡样芽胞杆菌。中山梨醇麦康凯培养基、木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐培养基、伊红美蓝培养基上的可疑菌落和阪崎杆菌显色培养基上的可疑菌落为同一菌落，都是阪崎肠杆菌[2]。

表1 E75/15肠杆菌科细菌生化鉴定

表2 API20E细菌生化编码鉴定系统

3 讨论

本次考核样检测出了单增李斯特氏菌、蜡样芽胞杆菌、阪崎肠杆菌共三株。通过这次食源性致病菌考核样的检测，总结出食源性致病菌鉴定经验，也提高了实验室的检测能力和水平。在此次考核检验过程中也发现了一些问题：（1）分离培养时尽量采用多种增菌液和选择性平板进行增菌培养和分离，比如这次检出的阪崎杆菌在多种培养基如营养琼脂、伊红美蓝、山梨醇麦康凯、木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐（XLD）上均能良好生长，在阪崎杆菌显色培养基和TSA培养基上呈典型生长。在检验过程中，应该尽量多地挑选可疑菌落进行生化鉴定，以防漏检。（2）做生化鉴定时，要将可疑菌进行分离纯化，不然会影响最后结果判定。（3）在做血清凝集实验时，选择的菌落应用纯培养菌落。在这次血凝实验中出现了木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐（XLD）上生长的可疑菌落与沙门氏多价O抗原发生交叉凝集，最后该菌落经生化反应鉴定证实为阪崎杆菌，在实际工作中常出现生化结果与血清凝集实验结果不符的情况，经过查阅文献资料见[3]，发现阪崎杆菌与多种菌有交叉凝集的现象，比如沙门氏菌F群血清等，所以不能单凭凝集反应而做出结论，还应结合生化判定。（4）随着致人类感染的致病微生物种、属的不断增加，以传统生化试验来鉴定微生物已不能适应鉴定的需要，而成套鉴定系统及编码鉴定方法如API20E细菌生化编码鉴定系统在实际工作中可以使细菌鉴定更加准确、简易、快速[4-6]。