PM2.5对小鼠肺部自噬、核因子相关因子2、核因子κB表达影响实验研究*

杜旭升，李东繁

西安交通大学医学院附属西安市中心医院呼吸与危重症医学科(西安710003)

近年来，汽车尾气、煤炭燃烧、建筑扬尘等产生的大量颗粒物，使大气污染愈发严重，由此形成的雾霾天气对人类日常活动和生命健康产生严重影响。在空气污染物中，细颗粒物(PM2.5)颗粒细小，传播远，表面有致病菌、重金属、多环芳烃等多种有毒有害物质，且可直接作用于下呼吸道，对呼吸系统疾病的影响最为明显[1]。自噬对细胞稳态的维持具有重要意义，为机体主要的溶酶体降解途径，研究发现，PM2.5等的外界刺激可引起活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平增加，使机体产生氧化应激反应，进而促使自噬的增强[2]。核因子相关因子2(Nuclear factor related factor 2，Nrf2)属于抗氧化调节因子，能够通过介导抗氧化因子的表达，达到减轻机体氧化应激反应的效果。核因子κB(NF-κB)为真核细胞中的核转录因子，机体中主要以p50/p65异二聚体形式存在，能够与多种细胞基因位点进行特异性结合， NF-κB与机体肿瘤坏死因子-α、白介素-6等炎症因子的相关性已被多项研究证实[3]。目前关于PM2.5对肺部自噬及Nrf2、NF-κB表达的影响机制尚未完全明确，因此，本研究通过建立不同浓度的PM2.5小鼠模型，对此进行了相关研究。

材料与方法

1 材 料 TEMED购自Amresco公司，磷酸酶抑制剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液和PMSF购自碧云天公司，兔抗P65、兔抗Nfr2购自武汉三鹰公司，胞浆胞核蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物公司，兔抗LC3B 购自Cell signaling公司，HRP标记羊抗兔二抗、HRP标记羊抗小鼠二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。选取SPF级BALB/c雄性小鼠32只，体质量18～20 g，随机分为正常组、低剂量组、中剂量组和高剂量组、每组8只。

2 实验方法 ①PM2.5制备： 于2016年11月15日起，将西安交通大学医学部实验楼顶作为PM2.5采集点，使用PM2.5中流量大气颗粒物采样器进行PM2.5的收集，连续收集两周。将采样滤膜剪碎后，置于甲醇中，并进行超声、洗脱、过滤、烘干等操作后，置于冰箱中保存备用。②PM2.5动物模型的制作： 使用具有通风口的4 L有机玻璃容器，正常组使用生理盐水，低剂量组、中剂量组和高剂量组使用PM2.5，浓度分别为25 mg/L、50 mg/L和100 mg/L，通过雾化进入容器中，每次将不同组别小鼠置于容器中熏绕30 min，3次/d，连续进行4周。于末次熏绕1 h后，将小鼠通过眼球放血进行处死，随后将肺脏取出，置于4%甲醛溶液中保存备用。

3 观察指标 ①不同浓度PM2.5对小鼠肺组织的影响： 将不同组别小鼠肺组织石蜡包埋后，进行切片、荧光染色后，置于显微镜下观察。②肺部自噬相关蛋白：LC3Ⅱ、 LC3Ⅰ表达的检测 对四组小鼠使用Western blotting法进行肺部自噬蛋白LC3Ⅱ、 LC3Ⅰ表达的检测，取小鼠肺部组织，匀浆后对肺部蛋白进行提取，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白浓度进行测定，蛋白质电泳分离蛋白后，分别将一抗Beclin1、LC3加入，封闭过夜后，加入二抗，扫膜后对LC3的光密度值进行计算，并使用LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ表示肺部自噬结果。③不同浓度PM2.5对小鼠Nrf2、NF-κB表达的影响：四组小鼠使用Western blotting法进行肺部组织中Nrf2、NF-κB p65蛋白表达的检测，取小鼠肺部组织，匀浆后对肺部蛋白进行提取，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白浓度进行测定，蛋白质电泳分离蛋白后，分别将兔抗Nfr2、兔抗P65、二抗加入，扫膜后对Nfr2、P65的光密度值进行计算，并使用Nfr2/LaminB、P65/LaminB的光密度值表示检测结果。④激光共聚焦显微镜下肺部细胞自噬的观察： 将人支气管上皮样细胞(Beas-2B)细胞接种至24孔板，使细胞覆盖至50%，培养后，分为两组，其中对照组仅转染pEGFP-LC3质粒，pEGFP-LC3质粒+PM2.5组在转染pEGFP-LC3质粒后，将细胞置于PM2.5浓度为100 mg/L的环境中暴露48 h，使用激光共聚焦显微镜对细胞自噬情况进行观察。

结 果

1 不同浓度PM2.5对小鼠肺组织的影响 正常组小鼠肺组织未见炎性改变，肺泡分布均匀、连接紧密，泡腔内无炎性细胞浸润，小支气管黏膜、支气管壁结构完整，肺部毛细血管未见出血。低剂量组小鼠肺组织发生部分炎性改变，肺泡结构较为完整，相比正常组明显偏大，肺泡中可见少量炎性改变，同时可见支气管黏膜损伤，并伴有少量出血。中剂量组小鼠肺组织炎性改变进一步加重，肺泡中可见大量炎性改变，肺泡间隙明显增加，并发生断裂、融合。高剂量组小鼠肺组织中可见肺泡、肺泡间隙、支气管被大量炎性细胞充满，肺泡同时可见严重断裂。见图1。

注：A：正常组HE染色；B：低剂量组HE染色；C：中剂量组HE染色；D：高剂量组HE染色

图1 不同浓度PM2.5对小鼠肺组织的影响(×100)

2 不同浓度PM2.5对小鼠肺部自噬相关蛋白LC3表达的影响 不同组别间，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ条带分吸光度比值明显不同(P<0.05)。与正常组相比，低剂量组、中剂量组和高剂量组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ条带分吸光度比值明显较高(P<0.05)，且呈现明显的浓度效应关系(P<0.05)。见图2、表1。

图2 不同浓度PM2.5对小鼠肺部自噬相关蛋白LC3表达的影响

表1不同浓度PM2.5对小鼠肺部自噬相关蛋白LC3表达的影响

注：与正常组相比，*P<0.05；与低剂量组相比，#P<0.05；与中剂量组相比，△P<0.05

3 不同浓度PM2.5对小鼠肺部Nrf2、NF-κB表达的影响 正常组Nfr2/LaminB、NF-κB p65/LaminB的光密度值明显低于低剂量组、中剂量组和高剂量组，PM2.5暴露可导致小鼠肺部细胞内Nfr2/LaminB、NF-κB p65/LaminB的光密度值明显增加(P<0.05)，且具有明显的浓度效应(P<0.05)。见图3、表2。

4 激光共聚焦显微镜下肺部细胞自噬的观察 对于仅转染pEGFP-LC3质粒的细胞，LC3在胞浆中均一表达，部分细胞细胞核中见少量LC3蛋白聚集，荧光强度较弱。对于转染的pEGFP-LC3质粒和PM2.5的细胞，LC3在细胞浆中呈现聚集性表达，细胞核内现少量明亮的荧光斑点，荧光强度明显增强。见图4。

图3 不同浓度PM2.5对小鼠肺部Nrf2、NF-κB表达的影响

表2不同浓度PM2.5对小鼠肺部Nrf2、NF-κB表达的影响

注：与正常组相比，*P<0.05；与低剂量组相比，#P<0.05；与中剂量组相比，△P<0.05

讨 论

PM2.5组成复杂，其内所含的多种毒害物质可伴随呼吸运动下沉至肺部，随后经由循环系统对神经系统、心脏等多个器官、系统产生危害，其中对于呼吸系统的影响最为直接[4]。有研究发现，无论PM2.5暴露时间为长期或者短期，均可对哮喘、慢阻肺、肺癌等呼吸系统疾病的发生发展产生一定影响[5]。目前多认为PM2.5对机体呼吸系统的影响主要通过氧化应激反应和炎症反应进行[6]。有研究发现，PM2.5进入机体后，可导致氧化-抗氧化平衡被打破，使ROS自由基在体内发生滞留，钙离子浓度增加，进而引起肺组织的氧化应激损伤[7]。也有研究发现，PM2.5能够成浓度依赖性的激活促炎因子基因的表达，并可使机体对病原菌的清除能力降低，进而使炎症因子水平提升，增加肺部感染发生的风险[8]。此外，PM2.5还可使细胞内钙离子浓度增加，促使钙离子信号通路激活，刺激炎症因子的释放[9]。本研究对不同浓度PM2.5对小鼠肺组织的影响进行了研究，结果表明，PM2.5对小鼠肺组织的影响呈现浓度依赖性，随着PM2.5浓度的增加，小鼠肺组织中的肺泡结构受损明显增强，炎性细胞浸润更为明显。

图4 激光共聚焦显微镜下肺部细胞自噬的观察

自噬为机体细胞的程序性死亡，是面对内外刺激时，机体产生的非损伤性应答。当发生自噬时，细胞质中处于游离状态的LC3Ⅰ逐渐转化为LC3Ⅱ，因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ可以用来表示细胞自噬程度。本研究结果发现，随着PM2.5浓度的增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显增加，表明PM2.5能够促进肺部细胞自噬的发生，且肺部细胞自噬程度呈现PM2.5浓度依赖性。本研究随后于激光共聚焦显微镜下对Beas-2B的自噬进行观察，结果证实PM2.5能够促进肺部细胞自噬的发生。有研究认为，PM2.5对小鼠肺部自噬的影响可能是通过对肺泡上皮细胞氧化应激的诱导产生[10]。也有学者对PM2.5对肺癌细胞自噬的影响进行了研究，结果表明，PM2.5可引起肺癌细胞的自噬，通过对自噬的阻碍有利于促进肺癌细胞的凋亡[11]。研究发现，对于脑缺血大鼠模型，适度自噬有助于对神经系统的保护，当自噬过度发生则会对大鼠神经功能产生影响，而通过对自噬抑制能够有效降低脑缺血损伤[12]。关于自噬程度对肺部疾病的影响还需进行更为深入的研究。

Nrf2为调节机体氧化应激反应的重要因子，其能够通过与ARE作用，达到对抗氧化蛋白的调控作用，进而起到降低外来刺激、机体炎症反应以及保护机体功能的效果[13]。研究发现，PM2.5能够刺激肺部组织Nrf2的表达，促进卵泡抑素的释放，使NADPH氧化酶-1分泌减少，进而使机体抗氧化能力提升[14]。本研究发现，PM2.5对小鼠肺组织Nrf2的影响呈浓度依赖性，随着PM2.5浓度的增加，Nrf2表达明显增强，提示PM2.5能够引起机体的氧化应激反应，进而对肺部组织产生损伤。NF-κB在调节炎症因子释放的过程中具有多向性，PM2.5可引起肺泡上皮细胞释放多种炎症因子，研究发现，这些因子的释放可能与NF-κB信号通路的激活有关，PM2.5可致机体产生氧化应激反应，刺激了NF-κB的表达，进而使炎症反应增加[15-16]。本研究发现，NF-κB的表达与PM2.5浓度变化呈现浓度依赖性，随着PM2.5浓度的增加，小鼠肺部组织中NF-κB p65的水平明显增加，进一步验证了PM2.5与肺部炎性改变的相关性。

综上所述，PM2.5能够使小鼠肺部组织发生炎性改变，且呈浓度依赖性的提高小鼠肺部自噬、Nrf2以及NF-κB水平，提示PM2.5通过使机体产生氧化应激以及炎症反应，导致肺部组织损伤，然而关于PM2.5对肺部病变的影响机制有待进一步的研究。